Ku80分子克隆在人肺癌细胞的表达及生物学意义

目的：研究Ku80基因分子克隆在人肺癌细胞的表达及生物学意义。方法；用分子克隆的方法构建重组的正义、反义Ku80基因表达质粒，导入人肺癌细胞后，用Northem－blotting法和Western－blotting法证明Ku80正义、反义基因在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果：（l）正义或反义Ku80克隆阳性的LCA细胞在mRNA水平均有正义或反义Ku80的表达印迹。（2）仅在正义Ku80克隆阳性的LCA细胞有正义Ku80蛋白表达印迹；而反义Ku80克隆阳性的LCA细胞无Ku80蛋白表达印迹。结论：正义或反义Ku80基因的分子克隆可在人肺癌细胞的mRNA得到表达，正义Ku80克隆阳性的LCA细胞有正义Ku80蛋白表达，反义Ku80基因可封闭肿瘤细胞的正义Ku80蛋白的表达。此结论为将Ku基因作为肿瘤靶向基因治疗提供了实验依据。

短干扰RNA抑制人宫颈癌HeLa细胞Ku80基因表达

目的针对内源性Ku80基因序列体外构建短干扰RNA(siRNA)线性DNA转录载体,观察其在细胞内产生的siRNA对该基因表达的影响。方法构建的线性DNA转录载体经脂质体导入宫颈癌HeLa细胞内,转录产生21 bp的短双链siRNA,并用免疫印迹法分析Ku80基因在蛋白水平表达的情况。结果体外成功构建出siRNA线性DNA转录载体LS1/LAS1和LS2/LAS2;载体分别导入HeLa细胞内生成相应siRNA;与空白对照组比较,实验组均能特异性抑制Ku80基因的表达;其抑制效果和时间点与所选基因靶位相关。结论由线性DNA载体转录生成的siRNA在细胞内特异性抑制内源性基因表达,为Ku80用于肿瘤靶向基因治疗提供了一个新的实验依据。

不同小麦基因型对γ射线辐照敏感性的分子解析

本研究以63份小麦品种(系)的风干种子为材料,分别利用0 Gy、100 Gy、150 Gy和250 Gy剂量的60Coγ射线辐照,通过种子发芽试验和基因表达等方法,探讨不同小麦基因型间辐射敏感性差异及辐射敏感性相关基因的表达模式。结果表明:根据苗高损伤效应,将63份不同小麦基因型分为敏感型(核优1号、中优206和太原703等)、较敏感型(旱选10号、济麦20和中麦175等)、较钝感型(德抗961、豫麦68和淮麦20等)和钝感型(衡观136、邯6172和偃展4110等)4类。所选材料γ射线辐照后,敏感型基因型中Ta Ku70和Ta Ku80基因诱导表达明显,钝感型基因型中Ta Ku70和Ta Ku80基因诱导表达不明显。本研究表明不同小麦基因型间辐射敏感性差异明显且与Ta Ku70和Ta Ku80基因表达模式有关。

DNA双链断裂修复蛋白表达水平与肿瘤细胞放射敏感性的关系研究

目的:检测肿瘤细胞株中DNA双链断裂修复蛋白(Ku80、DNA-PKcs和ATM)的表达水平和放射敏感性参数,探讨3个蛋白预示肿瘤细胞放射敏感性的价值。方法:培养4株人宫颈癌细胞HeLa、SiHa、C33A和Caski,3株人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-453,及1株人肺癌细胞A549,Western blot检测这8株细胞中Ku80、DNA-PKcs和ATM蛋白的表达水平;流式细胞仪检测X线(10 Gy,6 MV)照射48 h后的凋亡率;克隆形成实验检测SF2(surviving fraction at 2 Gy)值和α、β值;Pearson线性相关分析蛋白表达水平与照射后凋亡率、SF2值和α/β比值的相关性。结果:3种蛋白在同一株细胞中的表达及同一蛋白在不同细胞株的表达均存在明显差异;DNA-PKcs的表达水平与SF2之间存在正相关关系(r=0.723,P=0.043);Ku80和ATM的表达与SF2值间无明显相关关系(P>0.05)。3种蛋白与凋亡率和α/β比值均无相关性(均P>0.05)。结论:DNA-PKcs蛋白表达越高,细胞对放射线越抵抗,其表达水平可能成为指示肿瘤细胞放射敏感性的指标。

三孢布拉霉遗传转化体系的构建及应用

为解决三孢布拉霉转化过程中原生质体转化率低、孢子细胞壁厚难以导入外源载体等问题,本研究中构建了根癌农杆菌侵染原生质体的转化体系,同时克隆了与非同源末端连接修复途径相关的ku80基因,并将该转化体系应用于ku80的敲除中。将ku80基因敲除框插入双元载体pDHt-sk上构建了重组敲除载体pDH-85H3,通过化学转化法将敲除载体pDH-85H3导入根癌农杆菌LBA4404,并基于农杆菌介导法转化三孢布拉霉原生质体。结果表明,经潮霉素筛选和PCR鉴定,得到的20株转化子中,有18株的基因组插入了敲除框,转化率达90%。经鉴定有2株转化子发生了同源重组,敲除率为10%。该结论表明了根癌农杆菌介导三孢布拉霉原生质体转化技术的可行性。

DNA pol β,Ku80与鼻咽癌放射敏感性的关系

目的:研究人鼻咽癌细胞系CNE-2Z亚克隆株F1、S1放射后DNA修复相关基因DNA pol β和Ku80的表达,探讨CNE-2Z存在放射敏感性异质性的可能机理。方法:裸鼠体内移植瘤实验观察F1、S1放射后的体内增殖能力,采用Western blot、免疫细胞化学和免疫组织化学方法检测放射后F1和S1 DNA修复相关蛋白(DNA pol β、Ku80)的表达,Feulgen染色法和图像分析方法检测放射后F1、S1裸鼠体内移植瘤的DNA倍体及细胞周期分布情况。结果:未照射前F1细胞DNA pol β和Ku80的表达高于S1;放射后S1细胞DNA pol β及Ku80表达上调的时间较F1早,上调辐度大于F1。鼻咽癌细胞系CNE-2Z确实存在放射敏感性的异质性,放射后S1体内增殖能力大于F1,较多细胞处于有利于DNA修复的G2/M期(P<0.01)。放射后F1、S1裸鼠移植瘤细胞和组织中,DNA pol β和Ku80蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:本实验进一步证实了鼻咽癌细胞系CNE-2Z确实存在放射敏感性的异质性,F1、S1放射敏感性的差异与两株细胞的DNA修复相关基因(DNA pol β、Ku80)的表达差异所致的DNA SSB、DSB修复的速度和忠实性有关。

成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9敲除Ku80基因提高HEK293T细胞对阿霉素的敏感性

目的利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术将293T细胞中的Ku80基因敲除，建立Ku80敲除的293T细胞株，并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响。方法首先，设计识别针对靶位点的1对DNA Oligos，利用pSpCas9（BB）-2A-Puro （PX459）质粒构建表达导向RNA（sgRNA）载体。载体转染293T细胞。通过定点聚合酶链式反应（PCR）和T7E1内切酶酶切鉴定，确认所设计的sgRNA的有效性。进一步通过细胞有限稀释法和嘌呤霉素筛选，挑选单细胞克隆进行Western blot检测筛选出稳定敲除Ku80基因的293T细胞株。最后通过定点测序确认Ku80编码基因是否发生突变。使用阿霉素处理诱导DNA损伤，以磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）为指标检测DNA损伤，同时用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测Ku80敲除的293T细胞对阿霉素的药物敏感性。结果成功构建Ku80基因敲除的293T细胞，用阿霉素处理诱导DNA损伤并经过修复之后，对照组和Ku80敲除组γ-H2AX染色的阳性率分别为（30.67±2.49）%和（88.00±1.63）%（P=0.000），表明Ku80敲除的293T细胞的DNA损伤修复功能显著受到抑制。同时Ku80敲除显著提高293T细胞对阿霉素的敏感性，阿霉素对Ku80敲除组细胞和对照组细胞的生长抑制率分别为（53.99±1.29）%和（32.42±1.20）%（P=0.000）。结论293T细胞中敲除Ku80抑制了DNA损伤的修复和提高了细胞对阿霉素的敏感性。

一种高效的柑橘绿霉菌基因敲除体系的构建(英文)

研究目的:提高柑橘绿霉菌基因敲除效率。创新要点:低效的基因敲除与丝状真菌非同源末端链接(NHEJ)的DNA双链断裂修复途径有关。为提高柑橘绿霉病菌基因敲除效率,本研究利用农杆菌介导的转化体系,获得NHEJ途径中关键因子Ku80的缺失突变体(ΔPdKu80)。研究方法:与野生型菌株相比,以ΔPdKu80作为出发菌株,提高柑橘绿霉病菌PdbrlA和PdmpkA的基因敲除效率(见表1)。重要结论:ΔPdKu80的营养生长、产孢和致病性与野生型菌株基本一致。ΔPdKu80作为出发菌株,能显著提高柑橘绿霉菌的敲除效率。