槲皮素通过激活Kv1.5保护糖尿病大鼠冠脉损伤

目的研究槲皮素对糖尿病大鼠CA损伤的改善作用及该作用与Kv1.5的关系。方法 30只♂SD大鼠,随机分为3组:空白对照组、糖尿病组、"糖尿病+槲皮素"组。通过大鼠冠脉流量(coronary flow,CF)测定,观察槲皮素对糖尿病所致CF变化的影响;利用冠状动脉(coronary artery,CA)张力测定,观察槲皮素对糖尿病所致CA张力变化的影响;应用膜片钳记录CA血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)电压依赖性钾通道(voltage gated potassium channel,Kv)电流及测定CA VSMC Kv1.5 mRNA表达水平,探讨槲皮素改善糖尿病所致CA损伤的机制。结果糖尿病组CF较空白组明显下降,糖尿病大鼠饮食中补充槲皮素,可使得其CF有所增加;膳食补充槲皮素可减弱糖尿病大鼠CA对KCl的收缩反应(P<0.05);与糖尿病组相比,"糖尿病+槲皮素"组CA对Kv阻断剂4-AP的收缩幅度明显降低;糖尿病组大鼠CA VSMC Kv电流较空白组明显降低(P<0.05),膳食补充槲皮素可减小其降低幅度;RT-PCR结果表明,Kv1.5 mRNA相对表达量空白组最高,"糖尿病+槲皮素"组次之,糖尿病组最少。结论槲皮素对糖尿病CA损伤有保护作用,该作用与激活Kv1.5存在一定相关性。

人Kv1．5通道基因转染人胚胎肾细胞的研究

目的建立表达人Kv1.5通道的细胞模型。方法采用Lipofactamine 2000脂质体将人Kv1.5通道基因转染人胚胎肾细胞(HEK293),通过荧光显微镜和全细胞膜片钳技术观测人Kv1.5通道基因的表达。结果pcDNAHKv1.5真核表达载体转染HEK293细胞2d后,荧光显微镜可观察到人Kv1.5通道表达;3d后全细胞膜片钳技术记录到人Kv1.5通道基因编码的通道电流。结论pcDNAHKv1.5真核表达载体转染HEK293细胞为人Kv1.5通道的研究提供了良好的真核细胞表达系统和细胞模型。

Kv1.5在心房颤动中的作用研究进展

心房颤动是临床上最常见的心律失常,有较高的发病率及病死率,严重威胁人类健康。国内外研究表明,Kv1.5钾通道在人类心房肌细胞特异性表达,是心房肌细胞超速延迟整流钾电流的分子基础,此电流在心房复极过程中发挥重要作用,是心房颤动药物治疗的重要靶点。现对Kv1.5在心房颤动中的作用研究进展进行阐述。

Kv1.5蛋白对内毒素致血管内皮细胞氧化应激损伤的影响

目的研究Kv1.5蛋白对内毒素(LPS)所致血管内皮细胞氧化应激损伤的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),给予5μg/mL LPS刺激建立脓毒症细胞模型,并分为:空白对照组、LPS组、LPS+MT1组(以Kv1.5特异性通道阻滞剂MT 250nmol/L预处理30min)及LPS+MT2组(MT浓度为500nmol/L)。采用MTT法检测内皮细胞存活率;ELISA法检测细胞上清液中内皮细胞E-选择素(E-selectin)、细胞间粘附分子(ICAM-1)浓度变化;激光共聚焦显微镜观察内皮细胞内ROS水平;比色法检测脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与空白对照组比较,LPS组内皮细胞存活率明显下降[(32.54±1.87)%vs.(98.64±0.92)%,P<0.01],而LPS+MT1组及LPS+MT2组内皮细胞存活率分别为(77.39±1.15)%、(93.22±1.15)%,均较LPS组上升(均P<0.01);LPS组内皮细胞E-selectin、ICAM-1分泌增加(均P<0.01),予以250、500nmol/L MT预处理后,E-selectin、ICAM-1分泌减少(均P<0.01);激光共聚焦显微镜观察内皮细胞内ROS水平发现,LPS组细胞内ROS水平升高为空白对照组的(3.39±0.42)倍(P<0.05),予以250、500nmol/L MT预处理后,ROS水平分别为空白对照组的(1.88±0.36)倍、(1.46±0.47)倍,与LPS组比较,差异有统计学意义(均P<0.05);且LPS组较空白对照组MDA水平上升、SOD活性降低(均P<0.01),而MT预处理可降低MDA含量、增加SOD活性(均P<0.01)。结论 Kv1.5蛋白与内毒素诱导的血管内皮细胞损伤密切相关;MT通过阻断Kv1.5通道可减轻内皮细胞脂质过氧化损伤。

骨肉瘤Kv1.5钾离子通道表达意义的研究

目的研究表明,Kv1.5钾离子通道参与了多种肿瘤的生物学行为,但其在骨肉瘤中的表达和作用尚未明确。本研究拟检测Kv1.5钾离子通道在骨肉瘤中的表达,并探讨小干扰RNA(small interfering,siRNA)沉默Kv1.5表达后对骨肉瘤细胞增殖、周期和凋亡的影响及可能的调控机制。方法实验分组,Kv1.5-siRNA转染细胞为实验组,controlsiRNA转染细胞为对照组,未处理细胞为空白组。采用siRNA抑制Kv1.5的表达,并分别采用CCK-8法、克隆形成率、流式细胞仪和Tunel法检测MG-63细胞增殖、生长、周期和凋亡的变化。采用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测骨肉瘤细胞中周期和凋亡相关基因的表达水平。结果 Kv1.5在骨肉瘤细胞和组织中均异常高表达。CCK-8法检测结果示,Kv1.5-siRNA组细胞增殖水平为(53.87±5.91)%,与control-siRNA组的(99.14±7.87)%相比差异有统计学意义,Z=-3.49,P<0.001;与空白组(100.00±8.37)%相比差异有统计学意义,Z=-3.57,P<0.001。克隆形成实验结果示,Kv1.5-siRNA组克隆形成数为164.00±7.66,与control-siRNA组(223.20±11.41)相比,Z=-2.61,P=0.008;与空白组(228.20±12.62)相比,Z=-2.40,P=0.016。流式细胞周期结果示,Kv1.5-siRNA组G0/G1期所占比例为(68.81±0.55)%,与control-siRNA组(41.22±0.61)%相比,Z=-2.15,P=0.031;与空白组(40.79±0.52)%相比,Z=-2.31,P=0.029。流式细胞凋亡结果示,Kv1.5-siRNA组(30.23±1.74)%与control-siRNA组(14.10±1.27)%相比,Z=-2.04,P=0.039;与空白组(12.85±1.02)%相比,Z=-2.09,P=0.035。Tunel法结果示,Kv1.5-siRNA组凋亡指数为(35.20±3.14)%,与control-siRNA组(8.03±1.50)%相比,Z=-2.41,P=0.015;与空白组(8.22±1.32)%相比,Z=-2.25,P=0.019。沉默Kv1.5表达可明显下调骨肉瘤中Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E、Bcl-2和Bik基因的表达,同时上调p21、p27、Bax、Bcl-XL和Caspase-3基因的表达,与对照组相比,P值均<0.05。结论 Kv1.5钾离子通道参与了骨肉瘤细胞增殖、周期和凋亡的过程,其作用机制可能与调控周期依赖激酶和Bcl-2家族的相关因子有关。

西地那非抑制高肺血流肺动脉高压大鼠肺血管重构和上调肺血管Kv1．5mRNA表达

目的观察高肺血流肺动脉高压大鼠肺血管结构重建和肺血管电压依从钾通道Kv1．5mRNA表达变化，探讨口服西地那非对高肺血流肺动脉高压大鼠肺血管重构及肺血管电压依从钾通道Kv1．5mRNA表达的影响。方法将27只雄性SD大鼠随机分为对照组（n=9）、分流组（n=9）、分流＋西地那非组（n=9）。后两组大鼠通过腹主动脉-下腔静脉分流术建立高肺血流肺动脉高压动物模型。对分流＋西地那非组大鼠每天灌胃枸橼酸西地那非10mg·kg^-1·d^-1，对照组和分流组每天灌胃等量生理盐水。11周后，测定肺动脉平均压（n1PAP）及肺动脉收缩压（sPAP）；观察右室肥厚程度，计算右室重量／（左室＋室间隔）重量比值，以[RV／（LV＋S）]表示；计算肺中、小血管肌型动脉相对中膜厚度（RMT）；采用实时荧光RT-PCR定量法观察大鼠肺血管电压依从钾通道Kv1．5mRNA表达。结果与对照组比较，分流组大鼠TnPAP、sPAP、RV／（LV＋S）比值显著增高（P〈0．01），RMT显著增加（P〈0．01），肺血管Kv1．5mRNA表达水平显著降低（P〈0．01）。与分流组相比，分流＋西地那非组H1PAP、sPAP、RV／（LV＋s）比值显著低于分流组（P〈0．01），RMT显著降低（P〈0．01），肺血管Kv1．5mRNA表达水平显著升高（P〈0．01）。分流＋西地那非组mPAP、sPAP、Rv／（LV＋S）比值和RMT与对照组比较，差异均无显著性意义（P〉0．05）；两组大鼠Kv1．5mRNA表达水平也无显著性差异（P〉0．05）。结论高肺血流肺高压大鼠肺血管发生重构并且其肺血管Kv1．5mRNA表达下降，而口服枸橼酸西地那非抑制高肺血流肺高压大鼠肺血管重构和上调肺血管Kv1．5mRNA表达。

替米沙坦对表达在卵母细胞上Kv1.5通道的抑制效应

目的:研究替米沙坦对表达在卵母细胞上的克隆人类Kv1.5通道的作用,探讨其在心脏复极中的潜在效应。方法:在非洲爪蟾卵母细胞上异源表达克隆人类Kv1.5通道基因,使用双电极电压钳技术记录全细胞电流,检测药物对Ikur电流的影响。结果:替米沙坦以电压依赖性和浓度依赖性方式抑制Kv1.5通道电流,且对峰电流及1.5s末端电流的抑制效应不同,在1μmol/L浓度下,抑制效应分别达到(7.75±2.39)和(52.64±3.77),其半抑制浓度(IC50)分别为(2.25±0.97)μmol/L和(0.82±0.39)μmol/L。替米沙坦对通道的稳态失活没有显著改变,在对照条件下,V1/2的值为(14.47±3.71)mV,斜坡因子k为(23.24±3.86)mV;在1μmol/L替米沙坦作用下,V1/2和k的值分别为(14.38±4.62)mV和(26.26±5.04)mV(n=6,P>0.05)。同时,替米沙坦显著加速了Kv1.5通道的失活。在对照条件下,Kv1.5通道的失活慢时间常数是(693.74±23.16)ms,在应用1μmol/L替米沙坦后,其失活的慢时间常数下降为(523.85±10.28)ms(n=5,P<0.05)。结论:替米沙坦在临床有效浓度范围内能显著抑制表达在卵母细胞上的Ikur电流,提示它兼有选择性阻滞Kv1.5通道的作用。

Kv1．5蛋白与脂多糖诱导的血管内皮细胞损伤的相关性

目的探讨Kv1.5蛋白与脂多糖（LPS）诱导的血管内皮细胞损伤的相关性。方法LPS以浓度梯度（0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml）及时间梯度（0、6、12、24、48 h）作用于人脐静脉内皮细胞（HUVECs），应用流式细胞仪检测细胞凋亡率，建立内皮细胞损伤模型，并通过Western blot法检测内皮细胞中Kv1.5蛋白水平；分别予以75、125、250、500 mmol/L浓度的Kv1.5特异性通道阻滞剂（MT）预处理30 min阻断Kv1.5通道后，运用流式细胞术检测内皮细胞凋亡率，酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定内皮细胞损伤标志物内皮细胞特异性分子-1（endocan）、血管细胞间黏附分子-1（VCAM-1）的浓度。结果LPS浓度为0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml刺激HUVECs 24 h，内皮细胞凋亡率分别为（33.530±1.266）%、（35.530±0.551）%、（48.270±0.901）%、（51.600±2.179）%，与对照组比较差异有统计学意义（P值分别为0.025、0.027、0.011、0.004），且在LPS 5.0 μg/ml时作用最显著；LPS（5.0 μg/ml）处理内皮细胞6、12、24、48 h，内皮细胞凋亡率分别为（30.200±1.113）%、（32.470±0.814）%、（46.630±0.513）%、（50.870±1.498）%，与对照组比较差异有统计学意义（P值分别为0.027、0.025、0.012、0.006），并且在24 h时作用最明显；建立内皮细胞损伤模型适宜的条件为5.0 μg/ml LPS刺激HUVECs 24 h；同时可见不同浓度LPS组Kv1.5蛋白表达明显上调（P值分别为0.036、0.027、0.008、0.005），12、24、48 h时LPS组Kv1.5蛋白表达亦上升（P值分别为0.004、0.036、0.007），Kv1.5蛋白表达与LPS呈一定的浓度及时间依赖性。与LPS组比较，不同浓度梯度MT组（75、125、250、500 mmol/L）内皮细胞凋亡率明显降低（P值均为0.000），且细胞损伤标志物endocan（P值分别为0.001、0.000、0.001、0.006）及VCAM-1分泌减少（P值分别为0.006、0.000、0.000、0.000）。结论内毒素诱导损伤的血管内皮细胞表达Kv1.5蛋白增多；阻断Kv1.5通道能减轻内毒素诱导的血管内皮细胞损伤。