KyoT2结合蛋白KBP1对RBP-J介导的转录活性的影响

目的 :研究KyoT2与KyoT2结合蛋白 1(KyoT2 bindingprotein1,KBP1)之间的物理相互作用 ,以及这种相互作用对重组信号结合蛋白J (recombinationsignalbindingprotein Jκ ,RBP J)介导的转录活性的影响。方法 :体外GST pulldown、体内免疫共沉淀、哺乳动物细胞双杂交实验和报告基因实验证实 ,KBP1与KyoT2之间存在物理和功能上的相互作用。结果 :体内和体外证实 ,KBP1与KyoT2之间均存在相互作用。转录活性分析实验显示 ,过表达KBP1可拮抗RING1对RBP J介导的转录的抑制效应。结论

LIM结构域蛋白KyoT相互作用分子的筛选

KyoT为LIM结构域蛋白 ,可与转录因子RBP Jk相互作用。为了研究其功能 ,用酵母双杂交法筛选了与KyoT相互作用的蛋白。以KyoT2为诱饵筛选人淋巴结cDNA文库 ,从 5× 10 6 个克隆中共获得 4 2个阳性克隆。提取质粒进行酶切鉴定 ,获得 2 2个非重复克隆。对此 2 2个克隆进行序列分析 ,共获得 13种基因 ,其中包括已知的KyoT相互作用蛋白RBP Jk和两个未知基因。另一种被筛选到的已知基因是激活状态的信号转导物和转录因子 1活化物的抑制蛋白 (proteininhibitorofactivatedsignaltransducerandactivatoroftranscription 1,PIAS1)。由于KyoT在小鼠睾丸中表达较高 ,因此进一步探讨了KyoT2与PIAS1的相互作用。并首先在酵母中证实KyoT2与PIAS1的相互作用并得到阳性结果。进而在大肠杆菌中表达纯化了KyoT2蛋白 ,并以此为抗原制备了抗KyoT2多克隆抗体 ,再用GST pulldown实验验证了KyoT2和PIAS1在体外的相互作用。成功筛选了KyoT相互作用蛋白 ,发现并验证了KyoT与PIAS1的相互作用 。

LIM蛋白KyoT在小鼠胚胎发育中的表达

IM结构域蛋白KyoT可与转录因子RBP J相互作用而修饰Notch信号途径 .以往发现KyoT在成年小鼠肺脏、肾脏和睾丸中有特异性表达 ,为进一步明确KyoT在小鼠胚胎阶段的表达 ,故分析了KyoT在小鼠不同胚胎阶段的表达水平变化和胚胎 17天时各组织的表达分布 .采用RNA印迹发现KyoT在小鼠胚胎的各阶段均表达 ,而且胚胎 17天时表达水平最高 .进一步RNA印迹和免疫组织化学检测发现 ,KyoTmRNA和蛋白质在胚胎17天小鼠的肺、肾以及肌肉中均有高水平的表达 .上述结果提示 ,KyoT在小鼠胚胎发育过程中有特异性表达 ,且在胚胎 17天时KyoT表达器官分布与成年小鼠相似 ,特异性定位于肺、肾和肌肉等脏器 .

LIM蛋白KyoT2与人类紧密连接蛋白2的相互作用

KyoT是一种LIM结构域蛋白 ,是以RBP J为诱饵蛋白通过酵母双杂交系统得到的新分子。KyoT2可以抑制RBP J介导的转录。以KyoT2为诱饵蛋白 ,通过酵母双杂交筛选得到了人类紧密连接蛋白 2 (ZO 2 )的一种新的剪接体ZO 2 i3。序列分析表明 ,新的剪接体有 19个外显子 ,与已发表序列比较 ,见ZO 2 i3分子的激酶后区发生了改变。为排除酵母双杂交实验的假阳性 ,实验首先在酵母中验证KyoT2与ZO 2 i3的体外直接相互作用并得到阳性结果。进而在大肠杆菌中原核表达纯化带有His标签的KyoT2蛋白 ,使用抗His标签的抗体 ,通过GSTpull downassay验证KyoT2与ZO 2 i3的体外直接相互作用 ,也获得阳性结果。并通过酵母实验初步确定了其作用位点 ,即KyoT2通过LIM2结构域与ZO 2 i3相互作用。本实验验证了KyoT2与ZO 2 i3的相互作用 ,并初步确定其相互作用位点 ,对探讨KyoT的功能具有重要意义。

LIM结构域蛋白KyoT基因剔除小鼠的建立和表型分析

KyoT为一LIM结构域蛋白,可与转录因子RBP-Jk相互作用而调节其转录活性.构建了KyoT基因剔除载体,转染小鼠胚胎干细胞(ES细胞)后得到同源重组的ES细胞克隆.将此ES细胞注射入小鼠的囊胚泡得到嵌合小鼠,再经小鼠培育得到KyoT基因被剔除的小鼠.纯合子KyoT基因剔除小鼠不能表达有功能的KyoT蛋白.表型分析表明纯合子KyoT基因剔除小鼠腹腔B1B细胞数增加,提示KyoT可能参与B淋巴细胞的发育.

RBPJ与KyoT_2真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建含有myc-RBPJ(R218H)(recombination binding protein-J)、myc-KyoT2融合基因片段的质粒,并在真核细胞中表达、鉴定。方法:由本科室保存质粒酶切分别得到RBPJ(R218H)和myc-KyoT2基因片段,将RBPJ(R218H)基因插入载体PCMV-myc中,获得融合基因myc-RBP-J(R218H),将myc-RBPJ(R218H)和myc-KyoT2插入真核表达载体pIRES2-EGFP,构建真核表达载体myc-RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP、myc-KyoT2-IRES2-EGFP。以其瞬时转染HEK293细胞,应用免疫印迹与流式细胞术检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达。结果:正确获得myc-RBPJ(R218H)融合基因,DNA序列分析表明所构建的含myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合基因的质粒与设计相同,myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合蛋白与绿色荧光蛋白均正确表达。结论:成功构建了含有myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合基因的真核表达载体,并在真核细胞中正确表达,为进一步研究慢性粒细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。

Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP慢病毒载体的构建与鉴定

构建含有myc-KyoT2融合基因片段的病毒载体,并在真核细胞中表达鉴定。方法:由科室保存质粒分别酶切得到Plenti/V5、IRES2-EGFP和myc-KyoT2基因片段,分别将myc-KyoT2基因片段插入质粒pIRES2-EGFP得到myc-KyoT2-IRES2-EGFP,然后将myc-KyoT2-IRES2-EGFP基因片段插入质粒Plenti/V5-GFP,构建病毒载体Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,应用免疫印记和荧光显微镜检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达。获得了质粒myc-KyoT2-IRES2-EGFP和Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,myc-KyoT2融合蛋白和绿色荧光蛋白均正确表达。说明成功构建了含有myc-KyoT2-IRES2-EGFP融合基因的病毒载体,并在真核细胞中正确表达,为进一步研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。

过表达KyoT2对哮喘小鼠气道平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的研究KyoT2对哮喘小鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖和迁移的影响。方法卵白蛋白(OVA)诱导BALB/c小鼠建立哮喘气道重塑模型后,行ASMC分离和培养,并以原代培养的正常小鼠ASMC作为对照组。检测对照组和哮喘组小鼠ASMC中Kyo T2的表达。哮喘小鼠ASMC转染p CMV-Myc(空载体组)和过表达KyoT2质粒p CMV-Myc-KyoT2(KyoT2过表达组)48h后,采用RT-PCR和Westernblot方法检测各组KyoT2m RNA和蛋白表达;采用MTT法和Brd U法检测ASMC增殖;采用Transwell法检测ASMC的迁移。Westernblot用于检测过表达KyoT2对RBP-Jκ、PTEN和AKT蛋白表达水平的影响。结果与对照组比较,哮喘组ASMC中KyoT2表达下调,KyoT2过表达组ASMC中KyoT2表达显著上调(P<0.05)。与空载体组比较,KyoT2过表达抑制细胞增殖和细胞迁移(P<0.05);且KyoT2过表达能下调RBP-Jκ和AKT的表达,上调PTEN的表达(P<0.05)。结论 KyoT2抑制哮喘ASMC增殖和迁移,其机制可能是通过负调控RBP-Jκ/PTEN/AKT信号通路来实现。