L-N-(2-噻吩磺酰基)氨基酸乙酯衍生物的合成、结构及抗肿瘤活性

将2-噻吩磺酰基引入α-L-氨基酸乙酯中,设计合成了9种未见文献报道的新化合物N-2-噻吩磺酰基-α-L-氨基酸乙酯和N-2-噻吩磺酰基甘氨酸乙酯。结构经IR、1H NMR、MS和元素分析测试技术得以确证。对化合物3a的单晶进行了X射线晶体结构测定,结果表明,其属于单斜晶系,Cc空间群,晶胞参数a=1.4538(2)nm,b=0.56902(9)nm,c=1.4337(2)nm,Z=4,V=1.0978(3)nm3,Dc=1.508mg/m3,α=90.00°,β=112.245(2)°,γ=90.00°,F(000)=520,R=0.0858,wR=0.2265。经MTT法多次平行实验观测,结果发现,部分目标化合物对白血病K562细胞的增殖有明显的抑制作用:在质量浓度为1.0×10-8g/mL时,化合物3f、3g、3i对白血病K562肿瘤细胞的增殖有较好的抑制作用,抑制率分别为40.22%、33.47%和31.86%,化合物3a～3i对白血病K562肿瘤细胞的增殖的半数抑制质量浓度(IC50,1×10-6g/mL)依次为:35.65、13.87、9.23、4.9、9.24、8.16、7.84、7.73、7.73、6.57。实验中还发现,部分化合物能够诱导肿瘤细胞自然凋亡。通过与5-氟尿嘧啶(5-FU)阳性对照结果表明,该类化合物具有很好的研究开发潜力和价值。

密码子优化α-L-鼠李糖苷酶基因在酿酒酵母细胞的表面展示表达及产物的酶学性质

桑树富含黄酮苷类化合物,利用糖苷酶生物转化可有效提高其生物利用度,对挖掘桑树资源的药食用价值具有重要意义。天然来源的糖苷酶催化选择性强,但异源表达量低。以源自黑曲霉(Aspergillus niger)的α-L-鼠李糖苷酶基因rha为目的基因,改善该基因的密码子偏爱性和适应性,将密码子优化后的corha基因展示表达到酿酒酵母细胞表面,以达到高效催化的实用目的。与转入原始rha基因的重组酿酒酵母菌株相比,转入密码子优化corha基因的重组酿酒酵母菌株表面展示coRHA蛋白的表达量提高了2.9倍,培养60 h后coRHA的酶活力提高了2.7倍。以对硝基苯-α-L-鼠李糖苷(p NPR)为底物检测含corha基因重组菌株生产coRHA的酶活力,其最适p H及温度分别为5.0和45℃;以芦丁为底物,在p H 5.0、60℃条件下,coRHA水解芦丁合成异槲皮苷的得率为79.81%±3.1%。采用系统密码子优化策略,为利用工程菌工业化生产coRHA,用于催化桑树黄酮苷类化合物定向水解提供了可行的方法。

N-芳磺酰基α-烷基L-氨基酸酯的合成及其神经营养活性

目的设计合成N 芳磺酰基α 烷基L 氨基酸酯化合物 ,并对其神经营养活性进行初步评价。方法基于先期工作 ,以生物电子等排原理 ,设计合成系列N 芳磺酰基α 烷基L 氨基酸酯化合物 ,并运用体外PC12细胞存活模型和鸡胚背根神经节无血清培养方法 ,观察化合物的神经营养作用。结果共合成 32个目标化合物 ,其结构均经1H NMR和MS确证。结论化合物 3,5 ,10 ,12 ,13,14 ,15 ,2 0 ,2 1和 2 8可明显增强神经生长因子 (NGF)促PC12细胞体外存活活性 ;化合物 12 ,13,15 ,2 0和 2 8同时具有较强的促鸡胚背根神经节突起生长作用 ,其中化合物 12和 15活性突出 ,优于阳性对照化合物GPI - 10 4 6。

HL-60细胞内DNA甲基化作用与RNA聚合酶活力的关系

以 S-腺苷酰 - L-甲硫氨酸 ( SAM)为诱导物 ,在 1 0 μmol/L最佳浓度下可诱导 HL- 60细胞分化达 1 6%左右 .HPLC测定结果证明 ,诱导物处理后 HL- 60细胞 DNA甲基化水平升高 .通过 3 H-UTP同位素参入法 ,测定了不同处理时间和不同浓度 SAM对 HL- 60细胞 DNA模板体外转录活性的影响 ,发现体外活力下降 .比较了不同浓度α-鹅膏蕈碱存在下 RNA聚合酶活力的变化 ,结果表明 SAM处理后细胞中不同

以L-亮氨酸为底物一步法生物合成α-酮异己酸

α-酮异己酸是重要的有机合成和药物合成中间体,在食品、医药和化工行业中应用广泛。目前,α-酮异己酸的合成以化学法为主,需要高成本的催化剂或特殊的起始结构,导致α-酮异己酸生产成本较高。首次在食品安全性菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168中异源表达了普通变形杆菌(Proteus vulgaris)来源的L-氨基酸脱氨酶,以重组枯草芽孢杆菌作为全细胞催化剂、L-亮氨酸为底物实现了α-酮异己酸的一步法生物合成。其次,针对全细胞催化条件进行优化,最优条件(全细胞催化剂20 g/L、L-亮氨酸浓度100 mmol/L、反应温度45℃、pH 10.0、MgCl 2浓度5 mmol/L)下,转化24 h,可获得3.66 g/L的α-酮异己酸,且重复转化3次后,固定化细胞比游离细胞的再利用率提高了37.3%。该研究成功实现了以食品安全菌株B.subtilis 168为宿主一步法生物合成α-酮异己酸,为α-酮异己酸以及其他重要α-酮酸的工业化安全合成提供了新策略。

昆虫来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的酶学性质表征

选取突变体K49R进行分离纯化、酶学性质表征,并进行全细胞催化合成β-丙氨酸,旨在研究红粉甲虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,ADC)的酶学性质,并为生物法制备β-丙氨酸提供理论与技术支持。突变体K49R最适pH为6.5,在pH 6.0~7.0之间保持稳定;最适温度为42℃,热稳定性较野生型提高1.7倍;底物亲和力大幅提高,催化效率是野生型的1.8倍。在培养基中添加10 g/L葡萄糖可以有效提高重组菌的生物量,以及重组酶的可溶性表达量;在全细胞催化合成β-丙氨酸体系中,添加磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphate,PLP)可以缩短反应时间,提高催化效率。该研究开发了具有工业化潜力的工程菌,建立了绿色、高效的β-丙氨酸生物合成法,为β-丙氨酸生物合成的产业化奠定了重要基础。

易错PCR法提高L-氨基酸脱氨酶全细胞转化L-异亮氨酸生产α-酮-β-甲基正戊酸效率

对奇异变形杆菌Proteus mirabilis中的L-氨基酸脱氨酶进行定向进化,利用易错PCR技术向基因中引入随机突变,建立突变文库来筛选可获得较高α-酮-β-甲基正戊酸产量的突变株。突变株7/23-6最适全细胞转化反应条件是以pH 8.5 Tris-HCl为缓冲液,用900 mmol/L L-异亮氨酸在30℃下进行催化反应21～24 h,其α-酮-β-甲基正戊酸产量可以达到102 g/L,底物转化率达到87%。与对照菌相比,α-酮-β-甲基正戊酸产量和底物转化率均提高了13%,热稳定性提高了36.7%。

N'-乙氧羰基取代甲基-N-β-吡啶甲酰硫脲的合成及晶体结构

从α-L-氨基酸乙酯出发,设计合成了9种新N'-乙氧羰基取代甲基-N-β-吡啶甲酰硫脲衍生物.其结构经IR,1H NMR,MS和元素分析测试确证.对化合物7d的单晶进行了X射线晶体结构测定,其属于单斜晶系,C2空间群,晶胞参数a=1.6912(6)nm,b=0.5197(19)nm,c=1.9399(7)nm,Z=4,V=1.6962(11)nm3,Dc=1.266Mg/m3,α=90.00°,β=95.89°,γ=90.00°,F(000)=688,R=0.0667,wR=0.1709.经MTT法三次平行实验,首次发现部分目标化合物对白血病K562细胞的增殖有明显的抑制作用.

α-硫辛酸和乙酰左旋肉碱改善炎症细胞因子介导胰岛细胞功能障碍的作用

目的:探讨α-硫辛酸(α-lipoic acid,LA)和乙酰左旋肉碱(acetyl-L-carnitine,ALC)改善炎症细胞因子介导胰岛细胞功能障碍的效果并探讨机制。方法:大鼠胰岛素瘤RIN-m5f细胞用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)联合作用(TII)48 h造成损伤模型。LA和ALC干预48 h后噻唑蓝法检测胰岛细胞的活力情况,荧光细胞技术法检测细胞的形态学,流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)表达水平,放射免疫法检测胰岛素分泌情况,Western blotting检测细胞凋亡相关和胰岛素分泌相关蛋白表达情况。结果:TII作用48 h可使RIN-m5f细胞活力明显下降,凋亡增加;并降低基础状态下和高糖刺激状态下胰岛素分泌水平;增加ROS水平,增加一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性,增加一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)水平,促进NF-κB向细胞核转位;TII还可增加RIN-m5f细胞内促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达,抑制抗凋亡蛋白I-κB、Bcl-2表达,增加线粒体细胞色素c释放。而LA、ALC可改善TII诱导的RIN-m5f细胞凋亡,提高基础状态和高糖刺激状态下胰岛素分泌水平;抑制NF-κB向细胞核转位、降低细胞NO水平;降低Bax、Caspase-3表达,增加抗凋亡蛋白I-κB、Bcl-2表达,抑制线粒体细胞色素c释放;LA与ALC联合作用效果强于单独作用。结论:炎症细胞因子作用48 h可通过ROS-cytochrome c-NF-κB-NOS-NO通路最终引起胰岛β细胞的凋亡,进而影响胰岛素分泌;LA和ALC联用可抑制炎症细胞因子诱导的胰岛细胞凋亡,促进胰岛素分泌。

NAA对胡萝卜(Daucus carota)悬浮细胞茄红素合成的影响

通过对胡萝卜新透心红 DaucuscarotaCV.XinTouxinhong 细胞悬浮系单位鲜重细胞的茄红素含量、细胞总产量以及茄红素总产量的分析比较,研究了培养基中不同NAA浓度对胡萝卜细胞悬浮系茄红素代谢的影响.结果表明,NAA具有增强细胞茄红素代谢水平、提高单位鲜重细胞中茄红素的含量的作用,但对细胞的生长具有抑制作用.从茄红素单产和总产量综合评价,培养基中加入3.0mg·L-1NAA效果最佳.

二维数组的快速排序算法

在一维数组快速排序算法的基础上，给出了二维数组的快速排序算法。理论分析和大量的数值实验结果表明，其算法的平均计算时间仍然是Ｏ（ｎｌｏｇ２ｎ），一般所需的栈空间仍为Ｏ（ｌｏｇ２ｎ）。

运用α-吡啶羧酸筛选水稻抗稻瘟病细胞变异体的研究

利用α-吡啶羧酸为胁迫因子,研究了花药培养筛选水稻(Oryza sativa L.)抗稻瘟病(Pyricularia oryzae Cav.)细胞变异体的效果。α-吡啶羧酸可抑制水稻花药(粉)愈伤组织的形成与生长,用40mg-L α-吡啶羧酸进行诱导、继代和分化筛选,可获得抗性愈伤组织并再生绿苗,但仅有一半绿苗自然加倍结实,并具备对稻瘟病孢子悬浮液的抗性。经两代选择与鉴定,获得了抗稻瘟病 ZA_1和 ZB_(11)小种、但感 ZG_1小种的变异体2-07和4-091。

细菌内毒素诱导人肺腺癌细胞凋亡的实验研究

为了探讨细菌内毒素对人肺腺癌细胞株A549的影响及细胞凋亡与肿瘤坏死因子的关系,用含有细菌内毒素1000EU/mL、500EU/mL、100EU/mL、50EU/mL、0EU/mL的MEM细胞培养液来培养A549细胞,通过细胞计数来绘制细胞生长曲线,并用台盼兰拒染率测定细胞活率、用DNA梯形条带法及TUNEL原位法检测细胞凋亡情况.结果显示,细菌内毒素对肺癌细胞A549生长有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性,此种抑制是通过诱导细胞凋亡达到的.肿瘤坏死因子检测结果没有发现规律性.表明内毒素在体外可以诱导肺腺癌细胞的凋亡,且存在明显的剂量关系,并且此凋亡不是依赖TNF-α途径发生的,为临床上通过诱导细胞肿瘤细胞凋亡,从而为预防和治疗肿瘤提供了理论依据.

细胞因子激活的脐血单核细胞对K562细胞株杀伤作用的观察

[目的 ]观察及评价白细胞介素 2 (IL - 2 )及干扰素 -α(IFN -α)激活的脐血单核细胞对白血病细胞株K5 6 2的杀伤作用。 [方法 ]将细胞因子激活后的各组单核细胞 (Mφ)与K5 6 2细胞株按一定效靶比作用 4 8h ,采用MTT法检测各组的细胞毒效应。 [结果 ]单用IL - 2和单用IFN -α刺激的脐血单核细胞与K5 6 2细胞株作用 (效靶比 2 0∶1) ,其杀伤率分别为 (8.31± 1.32 ) %、(8.75± 0 .85 ) %。IL - 2联合IFN -α激活脐血单核细胞对细胞株的杀伤作用明显增强 ,效靶比 2 0∶1与5 0∶1时 ,杀伤率为 (4 1.5 2± 2 .33) %、(5 2 .6 6± 3.5 0 ) % ,与单用IL - 2及单用IFN -α组比较 ,具有显著性差异 ,P <0 .0 1,并提示杀伤率随效靶比的增加而增加。 [结论 ]IFN -α和IL - 2两者联合激活后的脐血Mφ对白血病细胞株的杀伤作用明显增强 ,杀伤率呈效靶比依赖关系。采用激活的脐血Mφ可用于干细胞移植时清除自体骨髓和外周血内的微小残留病变。

小鼠肾发育中胶质细胞系源性神经营养因子家族受体α1和受体酪氨酸激酶的表达

目的研究小鼠肾发育过程中胶质细胞系源性神经营养因子家族受体α1(GFRα1)和受体酪氨酸激酶(RET)的表达及意义。方法应用免疫荧光和蛋白印迹技术检测各胚龄小鼠肾组织中GFRα1和RET的时空定位表达及蛋白含量变化。结果在肾发育早期,GFRα1和RET在输尿管芽上皮细胞开始表达,生后肾组织内仅见GFRα1表达。随着肾小体的发育,GFRα1在肾小体发育早期即小泡体、逗号小体和S小体均有表达,而在肾小体发育后期即毛细血管袢期肾小体和未成熟期肾小体表达减弱,在成熟肾小体未见表达。RET在各期肾小体均未见表达。随着早期髓质的出现,GFRα1在近端小管、远端小管和集合管有明显表达;RET在集合管表达。在成熟肾脏,GFRα1定位表达于近端小管、远端小管和集合管;RET定位表达于集合管。GFRα1和RET在肾脏的蛋白表达量随胚龄的增加而增加,生后1 d达峰值,随后两者的蛋白表达量随日龄的增加而逐渐减少。结论在肾发育中,GFRα1参与肾小体发生、早期发育过程及肾小管和集合管的发生、发育过程,并维持其正常生理功能。RET参与集合管的发生、发育过程,并维持其正常生理功能。

钩藤总生物碱和芥子碱硫氰酸盐组分配伍对血管内皮细胞的变化作用和机制

目的研究中药组分钩藤总生物碱、芥子碱硫氰酸盐及其配伍对肿瘤坏死因子α(TNF-α)导致的血管内皮细胞的变化作用和机制。方法体外培养大鼠血管内皮细胞,以TNF-α建立血管内皮细胞炎症模型。采用扫描电镜技术观察细胞形态的变化,采用ELISA测定细胞分泌内皮素1(ET-1)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)和细胞间黏附分子1(ICAM-1),RT-PCR测定ICAM-1、VCAM-1和ET-1的mRNA表达,硝酸还原酶法测定细胞分泌血管内皮舒张因子一氧化氮(NO)水平。结果 TNF-α(5μg/L)可在体外诱导血管内皮炎症模型。钩藤总生物碱与芥子碱硫氰酸盐配伍可改善细胞形态结构,降低ET-1、ICAM-1和VCAM-1分泌,与钩藤总生物碱、芥子碱硫氰酸盐差异无显著性(P>0.05);提高细胞NO分泌,优于钩藤总生物碱、芥子碱硫氰酸盐(P<0.05);下调细胞ICAM-1 mRNA表达,优于钩藤总生物碱、芥子碱硫氰酸盐(P<0.05);下调细胞VCAM-1和ET-1 mRNA表达,优于芥子碱硫氰酸盐(P<0.05)。结论钩藤总生物碱、芥子碱硫氰酸盐及其配伍具有保护TNF-α致血管内皮细胞炎症的作用。

重组大肠杆菌全细胞催化合成β-丙氨酸

以L-天冬氨酸为原料,利用重组大肠杆菌全细胞合成β-丙氨酸,考察了pH调节剂、温度、底物初始pH、金属离子、辅酶添加量、底物浓度等因素对β-丙氨酸合成过程的影响。结果表明,在以氨水调节底物pH至6.5、温度60℃、底物质量浓度100 g/L的优化条件下,β-丙氨酸产量为24.0 g/L。研究发现反应过程中pH会不断升高,对全细胞转化产生不利影响。通过流加底物L-天冬氨酸,可解除pH升高对酶活性的抑制作用,从而提高生产效率,解决了重组菌生产β-丙氨酸受pH影响的问题。在此条件下转化仅7 h,β-丙氨酸的产量可达到24.2 g/L,生产效率提高了43%。

一菌双酶法转化富马酸生成β-丙氨酸

利用天冬氨酸转氨酶(AspAT)和L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联,以富马酸和氨作为底物催化合成β-丙氨酸(β-Ala)是工业合成β-丙氨酸的重要途径。但传统的双酶工艺需要分别发酵两个酶,且酶无法固定化。通过将AspAT和PanD构建入同一个大肠杆菌中,使其通过一次发酵就能产生两个酶,并且通过固定化通透细胞使酶可以重复利用。构建的工程菌的整体酶活为85.4U/g,固定化率为64.2%,固定化细胞最适反应温度为45℃,最适反应pH为7.5,最高可将质量浓度为300g/L的富马酸完全转化生成β-Ala,固定化细胞可连续使用12次。根据笔者提出的方法可简化酶的发酵工艺,进一步降低β-Ala的生产成本。

左旋四氢巴马丁抗动脉粥样硬化作用的体外研究

目的:研究左旋四氢巴马丁(l-THP)对TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与单核细胞THP-1的黏附作用及对血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响,探讨l-THP在抗动脉粥样硬化方面的作用。方法:以TNF-α刺激体外培养的HU-VECs细胞,加入不同浓度的l-THP处理,测定HUVECs与单核细胞THP-1的黏附能力,并用酶联免疫吸附实验(ELISA)及西点法(western blotting)测定血管细胞黏附分子-1的表达。结果:l-THP(30μM)可以明显抑制TNF-α诱导的HUVECs与THP-1的细胞间黏附作用,其黏附率仅为TNF-α组的70.37±1.64%;ELISA实验中30μM浓度的抑制率为38.36±0.5%;western blotting实验同样显示l-THP(30μM)能显著降低VCAM-1的表达。结论:l-THP能够抑制内皮细胞与单核细胞的黏附及VCAM-1的表达,提示其在抗动脉粥样硬化作用中具有潜在的价值。

小鼠诱导转基因传代细胞对AFP粪便标本中脊灰和其他肠道病毒的分离鉴别研究

报告４６份ＡＦＰ粪便标本用Ｌα、ＲＤ和Ｈｅｐ－２三种细胞作病毒分离，阳性率分别为２６．０９％、６０．８７％、４３．４８％。同步分离出脊灰病毒Ⅰ型３株，Ⅱ型２株，Ⅲ型４株，Ⅰ＋Ⅱ型１株，Ⅰ＋Ⅲ型１株，混合Ｐ２＋Ｅ１株。脊灰病毒总分离阳性率为２８．９５％。非脊灰肠道病毒分离阳性率分别为０％、３６．９６％、２３．９１％。从６份第１次分离结果阴性的高危病例和高度临床病例粪便标本重新分离出１株Ⅲ型脊灰病毒和３株非脊灰肠道病毒。应用Ｌα细胞不仅能作型别鉴定。