LAIR-1/LAIR-2(CD305/CD306)推定配体分布的研究

目的:研究LAIR-1(CD305)及LAIR-2(CD306)推定配体在多种细胞系上的分布,为鉴定LAIR-1/LAIR-2推定配体提供了实验依据。方法:建立稳定表达LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白的细胞系。以纯化的融合蛋白进行活细胞免疫荧光染色,用流式细胞仪检测LAIR-1及LAIR-2推定配体在多种细胞系膜表面的表达,并比较LAIR-1和LAIR-2推定配体的分布及可能结合的位点。结果:LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体均在人羊膜来源的上皮细胞系WISH上高表达,在人黑色素瘤细胞系C32、人胚肾上皮细胞系293T及人脐静脉内皮细胞系ECV304上有一定程度的表达。LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白与推定配体的结合,可分别被可同时识别LAIR-2和LAIR-1的单克隆抗体(mAb)FMU-LAIR-2.2和FMU-LAIR-2.1阻断。结论:LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体的分布基本一致,主要表达于WISH、C32、293T和ECV304细胞系。LAIR-1和LAIR-2可能拥有共同的配体。

LAIR-2单克隆抗体的制备、鉴定和夹心ELISA方法的建立

为了制备LAIR 2单克隆抗体并建立夹心ELISA方法。应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗LAIR 2单克隆抗体 (mAb )。采用间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定LAIR 2的细胞分布。辣根过氧化物酶 (HRP )标记LAIR 2mAb ,并建立检测LAIR 2的夹心ELISA方法。用重导向杀伤实验 (RCA )鉴定LAIR分子参与调节杀伤功能的关系。结果成功地制备了 3株特异识别LAIR 2的mAb ,1株mAb (3G4 )能够识别LAIR 1和LAIR 2的共同表位 ,但不能在重导向杀伤实验中抑制CD16诱导的杀伤功能。夹心ELISA方法检测LAIR 2的敏感性为 5ng/ml,为LAIR

LAIR-1/LAIR-2(CD305/CD306)与配体结合亲和力的比较

目的:LAIR-1/LAIR-2(CD305/306)与配体结合亲和力的比较。方法:应用不同浓度混合的LAIR-1和LAIR-2融合蛋白,同时或先后与配体表达细胞孵育后,用特异性LAIR-1或LAIR-2单克隆抗体(mAb)进行免疫荧光染色和流式细胞术(FCM)分析,比较LAIR-1和LAIR-2融合蛋白与细胞结合的百分率的变化及相互竞争情况。结果:LAIR-1和LAIR-2膜型配体的分布较广泛,人和小鼠LAIR受体与配体的结合具有相互交叉的特点。LAIR-2能够明显阻断LAIR-1与其膜型配体的结合,而LAIR-1对LAIR-2与其配体的结合无影响。结论:LAIR-1和LAIR-2可能结合相同的膜型配体,但LAIR-2结合配体的亲和力明显高于LAIR-1结合的亲和力。此结果为深入探讨LAIR家族免疫调节的分子机制提供重要的实验依据。

LAIR-1／LAIR-2（CD305／CD306）推定配体分布的研究

目的：研究LAIR-1（CD305）及LAIR-2（CD306）推定配体在多种细胞系上的分布，为鉴定LAIR-1／LAIR-2推定配体提供了实验依据．方法：建立稳定表达LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白的细胞系．以纯化的融合蛋白进行活细胞免疫荧光染色，用流式细胞仪检测LAIR-1及LAIR-2推定配体在多种细胞系膜表面的表达，并比较LAIR-1和LAIR-2推定配体的分布及可能结合的位点．结果：LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体均在人羊膜来源的上皮细胞系WISH上高表达，在人黑色素瘤细胞系C32、人胚肾上皮细胞系293T及人脐静脉内皮细胞系ECV304上有一定程度的表达．LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白与推定配体的结合，可分别被可同时识别LAIR-2和LAIR-1的单克隆抗体（mAb）FMU-LAIR-2．2和FMU-LAIR-2．1阻断．结论：LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体的分布基本一致，主要表达于WISH、C32、293T和ECV304细胞系．LAIR-1和LAIR-2可能拥有共同的配体．

Development of a quantitative ELISA kit for human secreted CD306/LAIR-2 and its application

AIM: A quantitative ELISA kit for the detection of human secreted CD306/LAIR-2 was developed using monoclonal and polyclonal antibodies which were raised against a highly purified recombinant human secreted CD306/LAIR-2. METHODS: Anti-human secreted CD306/LAIR-2 monoclonal and polyclonal antibodies were raised by immunizing mouse or rabbit with recombinant human secreted CD306/LAIR-2. The monoclonal antibody was purified by protein G affinity, whereas the polyclonal antibody was purified by protein A affinity. The best match pair of antibodies were found and used to develop a double antibody sandwich ELISA kit for the detection of human secreted CD306/LAIR-2 in human samples. RESULTS: A human secreted CD306/LAIR-2 ELISA kit was formulated with highly purified recombinant human secreted CD306/LAIR-2, highly specific monoclonal and polyclonal antibodies. This kit realized the quantitative measurement of recombinant human CD306/LAIR-2 and natural CD306/LAIR-2 in human serum samples. CONCLUSIONS: The developed human secreted CD306/LAIR-2 ELISA kit is a reliable quantitation immunoassay kit.

白细胞相关免疫球蛋白样受体2(CD306)真核表达载体构建及蛋白的纯化与鉴定

背景:目前国内外对白细胞相关免疫球蛋白样受体(leukocyte-associated immunoglobulin like-receptor,LAIR)家族中LAIR1的生物学功能研究已较清晰,而关于LAIR-2分子在机体内的生物学功能尚缺乏相关报道。目的:为进一步研究LAIR-2的体内生物学功能,构建其真核表达载体,纯化并鉴定蛋白。设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2007-06/2008-06在解放军第四军医大学完成。材料:载体pIg/3c由英国牛津大学徐小宁博士惠赠。载体pcDNA3.1由荷兰Meyaard博士惠赠。中国仓鼠卵巢细胞系CHO由解放军第四军医大学免疫学教研室冻存。方法:构建pIg/3c-LAIR-2及pcDNA3.1-LAIR-2两个真核表达载体,电转染法转染CHO细胞建立稳定表达LAIR-2-Fc融合蛋白及LAIR-2全长蛋白分子的细胞株,通过Westernblot、细胞免疫化学、流式细胞术分析实验鉴定真核表达LAIR-2蛋白分子与抗原核表达LAIR-2mAbs的结合活性。主要观察指标:稳定转染细胞系的建立及真核表达蛋白的纯化和鉴定。LAIR-2蛋白与相应单克隆抗体的结合活性。结果:构建真核表达载体并成功转染CHO细胞,建立稳定分泌LAIR-2-Fc融合蛋白的转染细胞系及稳定分泌LAIR-2蛋白的转染细胞系,分别命名为CHO/LAIR-2-Fc以及CHO/LAIR-2。Westernblot实验表明真核表达的LAIR-2全长蛋白分子均可与三株抗LAIR-2mAb1A7、3H12及4A9发生特异性结合反应。免疫细胞化学、流式细胞术分析实验结果表明抗原核细胞表达蛋白的三株LAIR-2单克隆抗体中,1A7不能结合pcDNA3.1-LAIR-2转染的CHO细胞内的LAIR-2,面3H12和4A9均可以很好结合细胞内的LAIR-2。结论:实验成功构建了pIg/3c-LAIR-2及pcDNA3.1-LAIR-2两个真核表达载体,成功转染CHO细胞并建立稳定表达LAIR-2-Fc融合蛋白及LAIR-2全长蛋白分子的细胞株。真核表达的LAIR-2蛋白分子与抗原核表达的LAIR-2mAbs有良好的结合活性。

胆汁可溶型抑制性受体LAIR-1以及白介素-2受体监测在肝移植急性排斥反应中的意义

目的 探讨胆汁中sLAIR-1及IL-2R的表达在肝移植排斥反应中的意义.方法 连续3周应用双单克隆抗体夹心ELISA方法检测55例肝移植受者术后胆汁sLAIR-1及sIL2R水平.结果 在22例移植肝功能正常的受体中（对照组）,胆汁sIL-2R在（23.1±3.5）～（55.1±6.1）ng/L范围之内呈较低水平的波动,sLAIR-1则波动于（3.2±1.1）～（6.1±1.4）ng/L范围之内,亦呈低水平表达.在急性排斥反应（AR）组,胆汁sIL-2R水平在排斥反应确诊前2 d为（116.1±10.3）ng/L,确诊前1 d则为（136.8±12.7）ng/L,均显著高于对照组（P＜0.01）.在经激素冲击治疗3 d时则下降至（74.2±6.2）ng/L,明显低于确诊前1、2 d水平.在对照组,胆汁sLAIR-1在（3.2±1.1）～（6.1±1.4）ng/L范围之内呈较低水平的波动;在AR组确诊前3 d为（18.1±2.2）ng/L,确诊前2 d为（25.1±3.5）ng/L,确诊前1 d则为（31.1±5.5）ng/L,均显著高于对照组（P＜0.01）;经激素冲击治疗3 d时,胆汁sLAIR-1水平下降至（8.1±2.5）ng/L,接近对照组水平,且sLAIR-1的下降早于sIL2R.结论 胆汁sLAIR-1在发生移植肝急性排斥反应的病人血清中有较高水平的表达,其波动较sIL-2R大,将二者联合进行监测,可望成为早期预测移植物排斥反应发生及转归的诊断指标.