LAMP-LFD技术在检测猪圆环病毒3型中的应用研究

为快速了解猪群中猪圆环病毒Ⅲ型(PCV3)的感染状况,本研究将环介导等温扩增技术(LAMP)与侧向流动试纸条(LFD)相结合,建立了快速检测PCV3 LAMP-LFD方法,并对该方法的特异性、灵敏性以及临床初步应用进行了验证分析。试验结果显示:常规PCR能检测到0.2 pg/μL的病毒,而本研究建立的LAMP-LFD能检测到0.2 fg/μL的病毒;引物、杂交探针只与PCV3发生反应,与其他病毒模板不发生反应;相较于常规PCR方法,LAMP-LFD方法时间更短(约1 h),且对仪器要求更低;在临床样品的检测中,常规PCR能检出的阳性样品,同时采用LAMP-LFD方法均能检出,且LAMP-LFD方法的敏感性更高于常规PCR。以上结果表明,本研究建立的PCV3 LAMP-LFD检测方法具有极高的灵敏性和特异性,操作简单反应快捷,且检测结果的可视化效果优于PCR和单一LAMP试验,在实际生产应用中具有更大的应用前景。

猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用

【目的】建立一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。【方法】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,针对猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)NS5B基因设计一套特异性引物及生物素标记探针,结合异硫氰酸荧光素标记的扩增产物,建立RT-LAMP-LFD检测方法。【结果】所建立的方法能够特异地检测出CSFV的存在,检测PRRSV、JEV、PCV-2等其他病毒均为阴性;所建立的CSFV-RT-LAMP方法对RNA的最低检测限为50 pg;反应快速,整个扩增反应可在1 h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察。【结论】应用RTLAMP-LFD检测CSFV特异性强、灵敏度高,并且操作安全、简便、快捷,可以满足基层检疫的需要。

基于LAMP-LFD技术的有害赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)快检方法

以东海原甲藻的ITS序列(Internal transcribed spacer,ITS)为检测靶标,将生物素标记的环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)扩增产物与经异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针特异性杂交,并结合横向流动试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)肉眼直接观察检测结果,建立了有害赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的快速检测技术。经优化后的最适条件为63°C、30min,较常规PCR扩增缩短约2h。结果表明:LAMPLFD可特异性检出东海原甲藻,对常见赤潮藻检测结果均为阴性;其对东海原甲藻基因组DNA的检测最低限为47pg/μL,是常规PCR技术(以F3/B3为引物)的10倍。LAMP-LFD技术能高效、特异地检出东海原甲藻,仪器设备依赖性低,结果可视化,有望成为赤潮原因种检测监控的常规方法。

桃拉综合征病毒的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)检测方法的建立

桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)是威胁虾类养殖业的主要病毒之一。本试验建立了一种快速检测TSV的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)方法,并与荧光定量PCR(qPCR)进行了对比。基于TSV的衣壳蛋白VP2核酸序列,设计3对特异性引物(外引物:FIP/BIP,内引物:F3/B3,环引物:LF/LB),进行LAMP反应体系的优化。其中引物LF以BIO标记,LB以FAM标记,用于横向流动试纸条(LFD)的检测。结果表明:LAMP最佳反应可在63℃恒温条件下40 min内完成。整个扩增反应到LFD结果判定可在45 min内完成。LAMP-LFD可特异性检出TSV特异性片段,未与其它病毒和细菌发生交叉反应,且其检测限为22.9 fg。与qPCR相比,本研究所建立的LAMP-LFD检测体系虽然检测限高于qPCR 10倍,但比qPCR检测时间缩短近1 h,且LAMP-LFD特异性强、操作简单,无需特殊仪器设备,可快捷、方便地检测出TSV,满足TSV基层快速检测的需要。

LAMP-LFD技术及其在生物快检方面应用

LAMP-LFD技术是环介导横温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification）与横向流动试纸条（Lateral flow dipstick）相结合的一种新颖的检测技术,该技术将核酸横温扩增和可视化试纸条检测有机地结合。环介导等温扩增技术（LAMP）,只需要在恒温（60℃~65℃）条件下保温几十分钟,即可将所需目的基因扩增到109水平。横向流动试纸条（LFD）,融合了免疫层析技术和分子生物学手段,能在纸条上形成有颜色的检测线从而可以特异性地检测出该目标产物。环介导横温扩增技术（LAMP）与横向流动试纸条（LFD）相互结合的技术,使LAMP扩增产物现场检测可视化,检测结果明显直观,通过肉眼即可辨认,并具有高特异性、高灵敏度、简便、安全及成本低的特点,一度引起科研工作者的广泛关注。综述了环介导横温扩增方法与横向流动试纸条相结合（LAMP-LFD）技术的原理、优势、及其在生物快速检测方面的应用等,并指出了LAMP-LFD技术目前存在的不足以及展望。

油菜茎基溃疡病菌LAMP-LFD检测方法的建立

本文基于环介导等温扩增技术与横向流动试纸条相结合的方法,建立了一种应用于油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)的LAMP-LFD快速检测方法。以油菜茎基溃疡病菌的ITS基因序列为靶序列,设计出一套用于LAMP-LFD检测的引物和探针,优化了反应体系与反应条件(63℃,35 min)。结果表明:只有油菜茎基溃疡病菌出现阳性条带,其他参照菌株和阴性对照均未出现阳性条带,说明LAMP-LFD检测特异性强;灵敏度检测表明,对油菜茎基溃疡病菌的检测极限可低至114 fg/μL,灵敏度比传统PCR高10倍;该方法可从进境船载油菜籽样品中成功检测出油菜茎基溃疡病菌,检测结果与传统的鉴定方法一致。LAMP-LFD检测方法能够快速检测油菜茎基溃疡病菌,具有简便、灵敏、特异性高,不依赖特殊检测设备等优点,极具推广前景。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD快速检测方法的建立及初步应用

针对肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHEC O157∶H7)的rfbE基因保守序列设计特异引物,通过优化反应体系、反应温度和反应时间等参数,建立了一种快速、简便的肠出血性大肠杆菌O157∶H7的环介导等温扩增-横向流动试纸条(LAMP-LFD)检测方法。特异性试验结果显示,该方法与大肠杆菌O8∶K88和O141∶K99、无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、产单核细胞李氏杆菌、表皮葡萄球菌、肠炎沙门菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等12种细菌均无交叉反应。灵敏度试验结果表明,该方法对纯培养的EHEC O157∶H7的检测下限为13CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测下限为18CFU/mL。研究结果表明,该方法特异性好,灵敏度高,操作简便,可肉眼直接判定结果,1h内完成检测,在食品卫生检验和临床疾病诊断方面具有良好的应用前景。

环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测草鱼呼肠孤病毒方法的建立

将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合建立一种快速检测草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的LAMP-LFD检测方法,并与实时荧光定量PCR(qPCR)技术进行对比。以GCRV S8片段为检测靶标,设计6条特异性引物(FIP/BIP,F3/B3,LF/LB),其中上游引物FIP以生物素(Biotin,BIO)标记,进行LAMP反应条件优化,同时设计1条羟基荧光素(Fluorescein amidite,FAM)标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果表明:LAMP最佳反应温度为63℃,反应时间40min。从LAMP扩增到LFD结果判读共需50min,比qPCR检测缩短近1h。LAMP-LFD与qPCR均可特异性检出GCRV,针对同一重组质粒的检测,LAMP-LFD的检测限为970fg,qPCR的检测限为97fg,虽然LAMP-LFD的检测灵敏度低于qPCR 10倍,但该方法操作简单,仪器设备依赖性低,可快速、特异地检测出GCRV,有望成为GCRV现场快速检测的常规技术手段。

环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测鳗利斯顿氏菌的研究

采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD),建立一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法。针对鳗利斯顿氏菌金属蛋白酶基因设计一套特异性引物及异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针,结合生物素标记的环介导等温扩增技术扩增反应和横向流动试纸条技术对鳗利斯顿氏菌进行检测;比较LAMP-AGE、LAMP-LFD和PCR-AGE的灵敏度;选取4株鳗利斯顿氏菌和6株非鳗利斯顿氏菌验证LAMP-LFD特异性。试验结果表明,应用LAMP-LFD,能在30 min内完成鳗利斯顿氏菌的检测;LAMP-LFD检测的灵敏度为7.7 cfu/ml,LAMP-AGE和PCR-AGE检测的灵敏度均为77 cfu/ml;4株鳗利斯顿氏菌均呈阳性反应,其他6株非鳗利斯顿氏菌均为阴性。应用LAMP-LFD检测鳗利斯顿氏菌特异性强、灵敏度高、并且操作安全、简便、快捷。

Performance of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)-Lateral Flow Detection and Xpert MTB/RIF Ultra for Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis

Background: Due to the limitations of diagnosis by Xpert MTB/RIF assay, WHO suggests Loop—Mediated Isothermal Amplification (TB-LAMP) instead of sputum-smear microscopy for pulmonary TB diagnosis in patients. Dr. Thongchai Kaewphinit et al. invented a fast TB detection kit called TB d-tect (LAMP-LFD assay). There was no clinical trial to estimate the performance of TB d-tect. Objective: This study was aimed to find the performance of LFD assay and Xpert MTB/RIF ultra for pulmonary TB. Material and methods: A cross-sectional study was conducted. Suggestive pulmonary TB patients were enrolled from June 2020-28 February 2021. Respiratory specimens were collected from each patient and sent for AFB smear, LAMP-LFD assay, Xpert MTB/RIF ultra and culture TB. Result: 139 patients with suspected pulmonary TB were enrolled. 51% of patients were diagnosed with pulmonary tuberculosis. Based on culture TB as a gold standard, the sensitivity and specificity of LAMP-LFD assay were 85.4% (95% CI: 70.8% - 94.4%) and 87.8% (95% CI: 79.6 - 93.5), respectively. The sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF ultra were 95.1% (95% CI: 83.5% - 99.4%) and 74.5% (95% CI: 64.7 - 82.8), respectively. According to ROC curve, it was found that the areas under the curve of LAMP-LFD assay and Xpert MTB/RIF ultra were 0.866 and 0.848, respectively (p = 0.546). Conclusion: The diagnostic sensitivity and specificity of LAMP-LFD assay appeared to be comparable to those of Xpert MTB/RIF ultra. LAMP-LFD assay could be used in resource limiting laboratory.

环介导等温扩增联合核酸层析试纸快速鉴定燕窝基原

目的:应用环介导等温扩增技术(LAMP)联合核酸层析试纸(LFD),基于燕窝中残留的线粒体DNA(mtDNA)建立燕窝基原的鉴定方法。方法:以不同生物基原的燕窝样品及伪品为研究对象,提取mtDNA,设计LAMP引物,建立LAMP扩增方法,并评价LAMP扩增浊度法检测与恒温水浴LAMP扩增联合LFD检测方法的特异性及灵敏度。结果:当反应温度为63℃时,燕窝线粒体中的细胞色素基因(mtDNA-cytb)的扩增效果最佳,而且LAMP扩增浊度检测与恒温水浴LAMP扩增联合LFD检测表现出一致的结果,均能有效区分燕窝样品的基原及伪品;在4.32×10~8～4.32×10~3 copies/μL的质粒标准品中具有良好的扩增检测效果。结论:LAMP扩增联合LFD的检测方法可以检测出燕窝核酸成分,对燕窝的基原鉴定具有良好的特异性和灵敏度,用于燕窝的检测快速准确,灵敏简便。

环介导等温扩增技术的应用及研究进展

环介导等温扩增(LAMP)技术自2000年被发明以来以其快速、灵敏、低耗等特点,引起众多研究者的关注。该技术在人、动物、植物、环境等相关微生物的检测、监控等领域得到了广泛研究与应用,其检测灵敏度普遍高于传统PCR 。但是传统LAMP技术对于产物检测存在耗时、易造成污染等问题,以及在野外或医疗点检测时存在判读不便的弊端。就LAMP技术与其他多种产物检测技术结合后的方法如目视LAMP、实时LAMP、微流控LAMP、横向流LAMP及电化学LAMP进行了总结、举例及讨论。目视LAMP具有费用低、适合多环境下使用的特点;实时LAMP、微流控及电化学LAMP法能够有效提高样品检测的准确度,且可减少检测时间;横向流LAMP具有可操作性强、便于判读等特点。根据目前LAMP技术的研究进展及各技术优劣势的分析,预测 LAMP技术未来发展的方向和重点可能为研发手持便携式检测仪。

登革病毒逆转录重组酶聚合酶扩增-测流层析试纸条检测方法的建立与评价

目的建立快速简便的登革病毒检验方法对控制登革热疫情至关重要。方法本研究首次建立了一种登革病毒的RT-RPA-LFD检测技术,结果本研究建立的RT-RPA-LFD检测技术能同时检测四种血清型的登革病毒,具有较好的重复性,特异性高,对乙型脑炎病毒、基孔肯雅热病毒、黄热病毒和塞卡病毒没有交叉检测,并且具有较高的检测灵敏度,对四种血清型的登革病毒检测限都低至10拷贝/反应。结论综合考虑其快速性和操作简便性,RT-RPA-LFD是一种非常有前景的登革病毒一线检测技术。