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Cloned s-Lap Gene Coding Area, Expression and Localization of s-Lap/GFP Fusion Protein in Mammal Cells
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作者 SONGYi-shu SONGZhi-yu +4 位作者 LIHong-jun WuYin BAOYong-li TANDa-peng LIYu-xin 《Chemical Research in Chinese Universities》 SCIE CAS CSCD 2005年第3期298-300,共3页
s-Lap is a new gene sequence from pig retinal pigment epithelial(RPE) cells, which was found and cloned in the early period of apoptosis of RPE cells damaged with visible light. We cloned the coding area sequence of t... s-Lap is a new gene sequence from pig retinal pigment epithelial(RPE) cells, which was found and cloned in the early period of apoptosis of RPE cells damaged with visible light. We cloned the coding area sequence of the novel gene of s-Lap and constructed its recombinant eukaryotic plasmid pcDNA3.1-GFP/s-lap with the recombinant DNA technique. The expression and localization of s-lap/GFP fusion protein in CHO and B_~16 cell lines were studied with the instantaneously transfected pcDNA3.1-GFP/s-lap recombinant plasmid. ~s-Lap/GFP fusion protein can be expressed in CHO and B_~16 cells with a high rate expression in the nuclei. 展开更多
关键词 s-lap gene Fusion protein Mammal cell EXPRESSION LOCALIZATION
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新基因s-lap编码区的克隆及其重组表达质粒PHB/s-lap的构建 被引量:2
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作者 宋忆淑 宋志宇 +3 位作者 费向东 贺冰 李玉新 谭大鹏 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期856-859,共4页
目的 :克隆新基因 s- lap编码区序列并构建其重组表达质粒。方法 :利用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR )方法 ,以可见光损伤早期的培养的猪视网膜色素上皮 (RPE)细胞 ds c DNA为模板 ,扩增新基因 s- lap编码区序列 ;利用基因重组技术构建 P... 目的 :克隆新基因 s- lap编码区序列并构建其重组表达质粒。方法 :利用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR )方法 ,以可见光损伤早期的培养的猪视网膜色素上皮 (RPE)细胞 ds c DNA为模板 ,扩增新基因 s- lap编码区序列 ;利用基因重组技术构建 PHB/ s- lap重组表达质粒。结果 :经测序证实获得了正确的新基因 s- lap编码区序列 ,酶切鉴定及 DNA序列分析表明已经将 s- lap基因编码区序列克隆到 PHB表达载体 ,成功地构建了 PHB/ s- lap重组表达质粒。结论 :成功地克隆了新基因 s- lap编码区序列 ,并构建了其重组表达质粒 PHB/ s- lap。 展开更多
关键词 基因 s-lap基因 克隆 分子 逆转录聚合酶链反应 基因表达 质粒
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RPE细胞光损伤相关新基因s-lap编码区克隆及s-lap/GFP融合蛋白在B16黑色素瘤细胞中的表达与定位 被引量:1
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作者 宋忆淑 李玉新 +2 位作者 费向东 鲍永利 谭大鹏 《眼科新进展》 CAS 2005年第1期11-13,共3页
目的 克隆新基因s lap编码区序列 ,研究其编码的蛋白质在B16黑色素瘤细胞内的表达与定位。方法 分析s lapcDNA序列 ,建立视网膜色素上皮 (retinalpigmentep ithelium ,RPE)细胞光损伤模型 ,RT PCR克隆其编码区序列 ,构建了带有绿色荧... 目的 克隆新基因s lap编码区序列 ,研究其编码的蛋白质在B16黑色素瘤细胞内的表达与定位。方法 分析s lapcDNA序列 ,建立视网膜色素上皮 (retinalpigmentep ithelium ,RPE)细胞光损伤模型 ,RT PCR克隆其编码区序列 ,构建了带有绿色荧光蛋白的目的基因真核表达重组质粒 pcDNA3 .1 GFP/s lap ,转染B16黑色素瘤细胞 ,观察s lap/GFP融合蛋白在B16黑色素瘤细胞内的表达与定位。结果 s lapcDNA序列含有编码10 1个氨基酸的开放读码框架 ,有 2个可能的N 糖基化位点 ,1个可能的caseinkinaseII磷酸化位点和 2个可能的PKC磷酸化位点 ;成功地克隆了s lap蛋白编码区序列 ,构建了其真核表达载体 ,荧光显微镜观察 ,在转染 pcDNA3 .1 GFP质粒的B16黑色素瘤细胞中 ,荧光呈网状分布于细胞浆内 ,而细胞核内低表达 ;在转染s lap/GFP融合基因的B16黑色素瘤细胞中 ,荧光均匀分布于整个细胞 ,尤其以细胞核内高表达。结论 新基因s lap编码的蛋白质可在B16黑色素瘤细胞中获得表达 ,并以细胞核内高表达。 展开更多
关键词 s-lap基因 克隆 s-lap/GFP 融合蛋白 基因表达 基因定位
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荷斯坦奶牛乳腺LAP基因的克隆与序列分析
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作者 程兰玲 曹贵方 +2 位作者 赵鹏伟 凃勇 包图雅 《湖南农业科学》 2012年第3期132-135,共4页
为了研究奶牛乳腺防御素基因的表达调控机制,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出LAP基因的核心片段序列,并与NCBI数据库序列比对同源性;进一步扩增其DNA序列中间片段;其后运用反向PCR技术并结合半巢式PCR技术扩增其侧翼的序列。... 为了研究奶牛乳腺防御素基因的表达调控机制,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出LAP基因的核心片段序列,并与NCBI数据库序列比对同源性;进一步扩增其DNA序列中间片段;其后运用反向PCR技术并结合半巢式PCR技术扩增其侧翼的序列。结果表明:序列与NCBI数据库中序列同源性为100%,确认为LAP基因;DNA序列扩增得到1 760 bp的中间序列,并预测了其酶切位点;得到5'侧翼序列107 bp,3'侧翼序列87 bp,经预测发现有转录因子GATA。为进一步研究防御素的防御功能、寻找防御素基因体外表达调控机制以及利用基因工程防治奶牛乳腺炎积累了基本资料。 展开更多
关键词 荷斯坦奶牛 乳腺炎 舌抗菌肽(lap)基因 反向PCR 防御素
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s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达与定位 被引量:1
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作者 宋忆淑 宋志宇 +2 位作者 费向东 贺冰 李玉新 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期39-41,共3页
目的 :观察 s- lap/ GFP融合蛋白在 Hela细胞中的表达及定位。方法 :根据 s- lap基因的编码区序列 ,应用 PCR技术突变其 3′末端终止密码子 ,并通过基因重组技术将其与 GFP基因融合 ,构建 s- lap/ GFP重组质粒 ;采用脂质体转染法 ,将 s-... 目的 :观察 s- lap/ GFP融合蛋白在 Hela细胞中的表达及定位。方法 :根据 s- lap基因的编码区序列 ,应用 PCR技术突变其 3′末端终止密码子 ,并通过基因重组技术将其与 GFP基因融合 ,构建 s- lap/ GFP重组质粒 ;采用脂质体转染法 ,将 s- lap/ GFP融合基因转入 Hela细胞中 ,用荧光显微镜观察其表达。结果 :s- lap/ GFP重组质粒序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜显示 ,在转染 GFP基因的 Hela细胞中 ,荧光呈网状均匀分布于细胞浆内 ,而细胞核内低表达 ;在转染 s- lap/ GFP融合基因的 Hela细胞中 ,荧光均匀分布于整个细胞 ,尤其以细胞核内高表达。结论 :s- lap/ GFP融合蛋白可在人 Hela细胞中表达 ,并主要定位于细胞核。 展开更多
关键词 s-lap/GFP融合蛋白 重组融合蛋白质类/遗传学 基因融合/方法 HELA细胞
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单核细胞增生性李斯特菌iap基因的原核表达 被引量:2
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作者 区燕宜 徐成刚 +2 位作者 叶贺佳 吴晓薇 廖明 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期108-111,共4页
该研究利用自行设计的引物通过PCR方法扩增出单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes C5305株的iap基因,在iap基因的5’端和3’端分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ2个酶切位点并将其克隆到pET-28a表达载体上,经PCR鉴定、酶切鉴定和核苷... 该研究利用自行设计的引物通过PCR方法扩增出单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes C5305株的iap基因,在iap基因的5’端和3’端分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ2个酶切位点并将其克隆到pET-28a表达载体上,经PCR鉴定、酶切鉴定和核苷酸序列测定后获得重组质粒pET-28a—iap,将该重组质粒转化入大肠杆菌B121(DE3)pLysS,经1mmol/LIPTG诱导4—6h后,通过SDS—PAGE及Westem-blotting鉴定,证明该基因得到表达,表达产物相对分子质量约为60000,以可溶形式存在. 展开更多
关键词 单核细胞增生性李斯特菌 iap基因 原核表达
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Dynamic expression of the LAP family of genes during early development of Xenopus tropicalis 被引量:3
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作者 YANG QiuTan LV XiaoYan +3 位作者 KONG QingHua LI ChaoCui ZHOU Qin MAO BingYu 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS 2011年第10期897-903,共7页
The leucine-rich repeats and PDZ (LAP) family of genes are crucial for the maintenance of cell polarity as well as for epithelial homeostasis and tumor suppression in both vertebrates and invertebrates.Four members of... The leucine-rich repeats and PDZ (LAP) family of genes are crucial for the maintenance of cell polarity as well as for epithelial homeostasis and tumor suppression in both vertebrates and invertebrates.Four members of this gene family are known:densin,erbin,scribble and lano.Here,we identified the four members of the LAP gene family in Xenopus tropicalis and studied their expression patterns during embryonic development.The Xenopus LAP proteins show a conserved domain structure that is similar to their homologs in other vertebrates.In Xenopus embryos,these genes were detected in animal cap cells at the early gastrula stage.At later stages of development,they were widely expressed in epithelial tissues that are highly polar in nature,including the neural epithelia,optic and otic vesicles,and in the pronephros.These data suggest that the roles of the Xenopus LAP genes in the control of cell polarity and morphogenesis are conserved during early development.Erbin and lano show similar expression patterns in the developing head,suggesting potential functional interactions between the two molecules in vivo. 展开更多
关键词 Xenopus tropicalis lap gene family Densin ERBIN Scrib Lano expression pattern
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重叠PCR技术在构建sodAP基因表达载体中的应用 被引量:1
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作者 叶艳华 何冰芳 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第9期762-764,共3页
目的应用重叠PCR技术,构建节杆菌DMDC12的Mn-SOD基因sodAP的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法设计两对引物,分别扩增启动子P121和sodAP基因序列,利用重叠PCR技术,将启动子P121与sodAP基因相连接并测序,连接产物插入原核表... 目的应用重叠PCR技术,构建节杆菌DMDC12的Mn-SOD基因sodAP的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法设计两对引物,分别扩增启动子P121和sodAP基因序列,利用重叠PCR技术,将启动子P121与sodAP基因相连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pET-22b(+),构建重组质粒pET-PsodAP,转化E.coliBL21(DE3)进行表达。用SDS-PAGE检测表达产物,光密度定量分析法分析目的蛋白表达量。结果启动子P121和sodAP基因的连接产物经凝胶电泳检测,可见约800bp的目的条带,测序结果与预期相符;重组表达质粒pET-PsodAP经双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得了表达,表达量占菌体总蛋白的19%。结论应用重叠PCR技术,成功构建了sodAP基因的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中获得表达,为Mn-SOD的进一步工业化生产奠定了基础。 展开更多
关键词 重叠PCR 节杆菌DMDC12 sodAP基因 表达载体
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含有鸡体偏嗜性密码子的H5亚型禽流感病毒HA基因的优化构建及其DNA疫苗体外瞬时表达研究 被引量:3
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作者 姜永萍 李呈军 +5 位作者 张洪波 步志高 张芳芳 邓国华 于康震 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期441-444,449,共5页
不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒的密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的表达A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA蛋白... 不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒的密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的表达A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA蛋白的基因optiHA5,并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIoptiHA5,将含有GD/1/96(H5N1)野生型HA基因的质粒pCIHA5和pCIoptiHA5分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24~48h293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白;Westemblot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果表明密码子优化的基因optiHA5体外瞬时表达水平显著高于野生型HA基因.这一结果为进一步开展SPF鸡免疫保护效果的比较研究奠定了基础. 展开更多
关键词 H5亚型禽流感病毒 HA基因 DNA疫苗 鸡体偏嗜性密码子 偏嗜性 寡核苷酸
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大仓鼠β_2肾上腺素受体基因的套叠PCR法多点突变研究 被引量:5
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作者 王迪 黄园园 +2 位作者 杨曙明 于洪峡 杨啸枫 《生命科学研究》 CAS CSCD 2008年第1期45-49,共5页
对大仓鼠β2肾上腺素受体蛋白(β2 adrenergic receptor,β2AR)进行立体结构与疏水性分析.利用套叠PCR法对β2AR基因进行多点突变,将保守跨膜域疏水氨基酸突变为正电荷亲水氨基酸,成功构建分别带有7个与3个突变氨基酸的原核突变表达载体... 对大仓鼠β2肾上腺素受体蛋白(β2 adrenergic receptor,β2AR)进行立体结构与疏水性分析.利用套叠PCR法对β2AR基因进行多点突变,将保守跨膜域疏水氨基酸突变为正电荷亲水氨基酸,成功构建分别带有7个与3个突变氨基酸的原核突变表达载体.探讨了套叠PCR的反应条件,为β2AR基因在体外的高量表达提供基础. 展开更多
关键词 β2肾上腺素受体基因 G蛋白偶联受体 套叠PCR 突变
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亮氨酸氨基肽酶基因多态性与原发性高血压相关性研究
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作者 袁晓 王兵 王晓春 《实用预防医学》 CAS 2007年第4期1002-1004,共3页
目的探讨脂细胞衍生亮氨酸氨基肽酶(A-LAP)基因的多态性与原发性高血压的相关性。方法采用关联分析,严格按照标准对湖南地区汉族随机选取,其中原发性高血压患者135例,正常对照135例。应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-R... 目的探讨脂细胞衍生亮氨酸氨基肽酶(A-LAP)基因的多态性与原发性高血压的相关性。方法采用关联分析,严格按照标准对湖南地区汉族随机选取,其中原发性高血压患者135例,正常对照135例。应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)对两组对象的A-LAP的828A>G多态性进行分析。结果AA,GG,AG三种基因型分布频率在正常对照组分别为61.5%、1.5%、37.0%,在高血压病组中分别为48.1%、5.9%、45.9%,两组间基因型频率比较χ2=7.075,df=2,P=0.029,差异有显著性;A和G等位基因分布频率在正常对照组中分别为80.0%、20.0%,在高血压病组中分别71.1%、28.9%,A和G等位基因频率比较χ2=5.775,df=1,P=0.016,差异有显著性。结论多基因联合分析显示,高血压病组A-LAP等位基因G的频率高于等位基因A,828A>G对发生原发性高血压的发生相对危险有协同作用。 展开更多
关键词 原发性高血压 基因多态性 A—lap
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重组质粒pPIC9K-oLHαhCGβCTP的构建及在毕赤酵母中的表达 被引量:4
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作者 王桂玉 刘润梅 +1 位作者 潘善培 李伟雄 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1999年第2期175-178,共4页
将人绒毛膜促性腺激素β-亚基的羧基肽(CTP)与羊黄体生成素(oLH)的α-亚基融合,通过设计两对引物,用部分重叠聚合酶链式反应(overlappingPCR)的方法构建了羊的α亚基CTP嵌合体.这个嵌合体被克隆到p... 将人绒毛膜促性腺激素β-亚基的羧基肽(CTP)与羊黄体生成素(oLH)的α-亚基融合,通过设计两对引物,用部分重叠聚合酶链式反应(overlappingPCR)的方法构建了羊的α亚基CTP嵌合体.这个嵌合体被克隆到pPIC9K质粒中,用电打孔方法转入巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris),并获高效表达.表达蛋白经SDS-PAGE和Western印迹证明分子量约为28kD.2.5L发酵罐大量培养,产量可达2.0g/L. 展开更多
关键词 HCG PCR 部分重叠 巴氏毕赤酵母 基因表达
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李斯特菌多重PCR检测方法的建立 被引量:2
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作者 陈健舜 朱凝瑜 +2 位作者 孔蕾 何中央 方维焕 《中国渔业质量与标准》 2013年第1期87-93,共7页
李斯特菌属包含6个种,致病力存在差异,其中单增李斯特菌是重要的人兽鱼共患食源性病原菌。比较基因组学研究表明,细胞壁水解酶基因iap存在于李斯特菌各个种,具有两端保守区与中间可变区;liv22-228基因区域则特异存在于伊氏李斯特菌。通... 李斯特菌属包含6个种,致病力存在差异,其中单增李斯特菌是重要的人兽鱼共患食源性病原菌。比较基因组学研究表明,细胞壁水解酶基因iap存在于李斯特菌各个种,具有两端保守区与中间可变区;liv22-228基因区域则特异存在于伊氏李斯特菌。通过对iap竞争性PCR与liv22-228特异性PCR的反应条件优化,建立可同时鉴定李斯特菌各个种的多重PCR反应体系,敏感性达102CFU/mL,对其余15种细菌均无扩增。将该反应体系应用于135株疑似李斯特菌的水产品分离株,并结合种别确证试验,表明该多重PCR的准确率达100%。该检测体系操作简便,并具有较高的特异性、灵敏性、准确性与稳定性,能够满足水产品中李斯特菌快速筛选与种别鉴定的需求。 展开更多
关键词 李斯特菌 种别 IAP liv22—228 多重PCR 检测方法
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奶牛LAP基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达 被引量:1
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作者 曹随忠 袁曦 +2 位作者 栾红雨 余树民 刘宗平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期521-524,共4页
根据GenBank上发表的牛舌抗菌肽(Lingual antimicrobial peptide,LAP)基因cDNA序列设计1对特异引物,从患乳腺炎的奶牛乳腺组织中以RT-PCR方法扩增LAP基因片段,将其克隆到pMD19-T Simple载体中测序。重组质粒经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切回收... 根据GenBank上发表的牛舌抗菌肽(Lingual antimicrobial peptide,LAP)基因cDNA序列设计1对特异引物,从患乳腺炎的奶牛乳腺组织中以RT-PCR方法扩增LAP基因片段,将其克隆到pMD19-T Simple载体中测序。重组质粒经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆入增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中构建重组融合表达质粒pEGFP-LAP,将其脂质体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察到融合表达的绿色荧光蛋白,采用RT-PCR检测到LAP基因在COS-7细胞中转录。pEGFP-LAP重组表达质粒的成功构建为进一步研究奶牛LAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳腺炎奠定了基础。 展开更多
关键词 奶牛 Β-防御素 lap基因 绿色荧光蛋白 真核表达
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人IL35-IgG4(Fc)融合蛋白在CHO/DG44细胞中的稳定表达 被引量:2
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作者 唐静 高闻达 +4 位作者 张青 张大为 陈洋 何波 刘全胜 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期109-115,共7页
本研究利用基因重组技术构建人IL35-IgG4(Fc)融合基因真核表达载体,稳定转染CHO/DG44细胞并检测重组蛋白的表达。主要采用聚合酶链式反应(PCR)从脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的人髓性白血病细胞株KG-IcDNA文库中克隆EBI3和IL-12... 本研究利用基因重组技术构建人IL35-IgG4(Fc)融合基因真核表达载体,稳定转染CHO/DG44细胞并检测重组蛋白的表达。主要采用聚合酶链式反应(PCR)从脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的人髓性白血病细胞株KG-IcDNA文库中克隆EBI3和IL-12p35cDNA,重叠PCR法连接2个片段,并克隆到IgG4(Fc)-pOptiVECTM-TOPO载体上,对新构建的IL-35-IgG4(Fc)pOptiVECTM-TOPO真核表达载体并进行酶切、测序、PCR鉴定;脂质体法转染CHO/DG44细胞;RT-PCR检测转染结果,采用a-MEM-培养基筛选实验组细胞,对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤(Methotrexate,MTX)的加压筛选,ProteinG-Agarose纯化阳性克隆培养上清,免疫印迹检测目的蛋白表达。结果显示IL-35-IgG4(Fc)pOptiVECTM-TOPO表达载体稳定转染CHO/DG44细胞并获得阳性克隆;SDS-PAGE电泳得到一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带;该蛋白能与羊抗人IgG4抗体特异结合。本实验获得了能够稳定表达具有稳定结构的IL35-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞株。 展开更多
关键词 IL-35-IgG4(Fc)融合蛋白 重叠PCR 稳定转染 CHO/DG44细胞 MTX诱导的基因扩增
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