LASS2/TMSG-1基因过表达对人肺癌95D细胞体外侵袭迁移能力的影响及其机制

目的分析LASS2/TMSG-1基因过表达对人肺癌95D细胞体外侵袭迁移能力的影响,初步探讨LASS2/TMSG-1基因的作用机制。方法运用脂质体转染法将前期已构建好并冷冻保存的Pc DNA3-TMSG-1质粒通过脂质体转染法瞬时转染入95D细胞(高转移潜能,LASS2/TMSG-1低表达),使外源性LASS2/TMSG-1基因在细胞内过表达即LASS2/TMSG-1过表达组,同时设立转染空白质粒的空白对照组和未转染质粒的阴性对照组。应用体外侵袭及迁移实验检测人肺癌95D细胞侵袭及迁移能力的变化;应用qRT-PCR和Western blot法检测LASS2/TMSG-1 mRNA及蛋白的表达;应用Western blot法检测ATP6L、MMP-2及MMP-9在细胞中的表达水平;应用明胶酶谱法检测肿瘤细胞中MMP-2及MMP-9的活性;使用比色法检测细胞中V-ATPase的活性;使用BCECF H+敏感探针检测细胞外H+浓度的变化。结果 LASS2/TMSG-1过表达组细胞的LASS2/TMSG-1表达水平明显升高,而ATP6L表达水平下降,其V-ATPase活性及细胞外H+浓度降低,与空白对照组和阴性对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05);MMP-2、MMP-9的表达及活性均降低,与其他两组相比差异有统计学意义(P<0.05);并且LASS2/TMSG-1过表达组细胞的体外侵袭及迁移能力明显低于其他两组(P<0.05)。结论 LASS2/TMSG-1可能通过结合ATP6L亚基抑制V-ATPase活性,改变细胞外H+浓度,影响MMP-2、MMP-9的表达及活性,进而改变肿瘤细胞的体外侵袭迁移能力等生物学行为。

不同转移潜能人肺癌细胞系中LASS2/TMSG-1的表达及其意义

目的探讨LASS2/TMSG-1在不同转移潜能人肺癌细胞系中的表达及其意义。方法培养95C细胞(人肺巨细胞癌低转移亚系)和95D细胞(人肺巨细胞癌高转移亚系)。采用MTT增殖实验、Transwell侵袭实验、划痕修复实验检测95C和95D细胞的增殖、侵袭及迁移能力;分别用RT-PCR和Western blot法检测两株细胞中LASS2/TMSG-1 mRNA和LASS2/TMSG-1、MMP-9、MMP-13蛋白的表达水平。结果 MTT增殖实验显示,培养至第2-5天,95D细胞的增殖能力强于95C细胞(P<0.05);95D细胞的侵袭能力显著高于95C细胞(t=-20.62,P<0.05);划痕修复实验证实95D细胞的迁移能力强于95C细胞(t=23.56,P<0.05)。LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白在95C细胞中的表达明显高于95D细胞中的表达,差异具有显著性(P<0.01)。MMP-9及MMP-13蛋白在95C细胞中的表达明显高于在95D细胞中的表达(t=-7.009,-13.042;均P<0.01)。结论 LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白在人肺癌低转移亚系95C中的表达显著高于在高转移亚系95D细胞中的表达。该基因可能参与抑制人肺癌细胞的增殖、侵袭及迁移过程,并且可能通过其下游基因MMP-9、MMP-13发挥重要的作用。

LASS2/TMSG-1基因沉默对人前列腺癌细胞生物学功能的影响及其机制

目的探讨LASS2/TMSG-1基因沉默对PC-3M-2B4细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其作用机制。方法将实验分为3组:空白对照组(仅转染PBS的PC-3M-2B4细胞)、无关阴性对照siRNA组及LASS2/TMSG-1 siRNA转染组。首先针对LASS2/TMSG-1基因,设计并合成siRNA;在脂质体介导下瞬时转染人前列腺癌PC-3M-2B4细胞24 h后分别采用Western blot和RT-PCR技术检测细胞内LASS2/TMSG-1蛋白及ATP6L mRNA表达水平;使用BCECF AM H+敏感荧光探针检测转染24、36、48、96 h后3组细胞的细胞内H+浓度;用MTT法检测细胞增殖;划痕修复实验和Transwell体外侵袭实验分别检测PC-3M-2B4细胞的迁移和侵袭能力。结果转染LASS2/TMSG-1 siRNA 24 h后,LASS2/TMSG-1 siRNA组LASS2/TMSG-1蛋白表达与对照组相比下降65%,ATP6L mRNA表达水平与对照组比较提高75%。通过BCECF AM荧光探针检测LASS2/TMSG-1 siRNA转染组细胞内H+浓度明显下降,且与空白对照组及无关阴性对照siRNA组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。MTT法检测显示,PC-3M-2B4细胞在转染24、48 h后,3组细胞生长速度无明显差异(P>0.05);转染72 h后LASS2/TMSG-1 siRNA转染组细胞生长速度明显升高,与空白对照组、无关阴性对照siRNA组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。划痕修复试验和Transwell体外侵袭实验显示,转染LASS2/TMSG-1 siRNA 24 h后,与空白对照组及无关阴性对照siRNA组相比,能显著促进细胞迁移和侵袭能力(P<0.05)。结论体外合成的siRNA能有效沉默LASS2/TMSG-1基因表达,同时上调V-ATPase质子泵中关键性亚基—ATP6L mRNA的表达水平,且基因沉默后其细胞内H+浓度下降,提示LASS2/TMSG-1基因可能与ATP6L相互作用、共同参与对细胞内pH值的影响,导致肿瘤细胞内外微环境的改变并影响肿瘤细胞的生物学行为,如增殖、迁移及侵袭能力。

LASS2/TMSG-1基因与肿瘤转移关系的研究进展

人源性长寿保障基因2(homo sapiens longevity assurance homologue 2,LASS2)是一个与酵母长寿保障基因1(longevity assurance gene1,LAG1)高度同源的人类基因,又被称为肿瘤转移抑制相关基因1(tumor metastasis suppressor gene-1,TMSG-1)。目前研究发现LASS2/TMSG-1与神经酰胺合成密切相关,同时其与V-ATPase质子泵的相互作用被认为是抑制肿瘤转移的机制之一,多种肿瘤的转移都与此基因的表达相关。

LASS2/TMSG-1基因对肿瘤疾病和神经损伤修复的影响

人源性长寿保障基因2(LASS2)是中国发现并命名的一个肿瘤转移抑制基因,也被称作肿瘤转移抑制相关基因1(TMSG-1),能够通过抑制V-ATPase质子泵活性、调节神经酰胺表达、调控转录过程等途径抑制人类多个系统的肿瘤的生长、浸润及转移,LASS2的表达与肿瘤的临床分期、预后和耐药性密切相关,同时有新的研究提出LASS2/TMSG-1能够参与调控正常细胞的迁移从而促进神经损伤的修复,现就LASS2/TMSG-1基因在相关疾病中表达的意义及可能的作用机制和应用前景的研究现状做一综述。

LASS2/TMSG-1、TAK1和TAB1在结肠癌中的表达及临床意义

[目的]探讨肿瘤转移抑制基因-1(LASS2/TMSG-1)、转化生长因子激活激酶1(TAK1)和转化生长因子β活化激酶结合蛋白1 (TAB1)在结肠癌组织中的表达及其临床意义。[方法]选取2017年1月至2018年2月在我院治疗的原发性结肠癌患者68例,分别取其结肠癌组织及癌旁正常组织,采用实时聚合酶联法(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)测定组织中的LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1表达水平,分析结肠癌组织中LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1的表达水平以及与患者临床病理特征的相关性,采用COX回归分析分析LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1表达水平与患者预后的相关性。[结果]结肠癌患者结肠癌组织TAK1(0.76±0.15ng/ml)、TAB1(1.46±0.20ng/ml)的表达水平与癌旁正常组织(0.57±0.15ng/ml,1.21±0.19ng/ml)相比显著升高;LASS2/TMSG-1的表达水平(1.52±0.36ng/ml)与癌旁正常组织(2.36±0.43ng/ml)相比显著下降(P<0.05)。LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期显著相关(P<0.05)。术后12个月随访时共有8例(11.76%)患者出现肿瘤复发/转移。出现肿瘤复发/转移的患者其TAK1、TAB1水平(0.96±0.15ng/ml,1.68±0.19ng/ml)与未复发/转移(0.52±0.13ng/ml,1.26±0.20ng/ml)患者相比显著升高;LASS2/TMSG-1显著下降(1.74±0.38ng/ml vs 3.02±0.49ng/ml)(P<0.05)。COX回归分析结果显示,肿瘤分化程度、肿瘤TNM分期、LASS2/TMSG-1、TAK1及TAB1表达水平是影响结肠癌患者临床预后的独立因素。LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1表达水平之间无显著相关性(P>0.05);患者预后与LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1表达水平具有显著相关性(P<0.05)。[结论] LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1的表达水平可能与结肠癌的发生及发展具有相关性,且与患者临床预后相关。

LASS2/TMSG-1基因沉默对人肺癌95C细胞侵袭迁移机制探讨

目的 LASS2/TMSG-1是近年来新发现的一种肿瘤转移抑制基因本实验主要研究沉默LASS2/TMSG-1基因对人肺癌细胞系低转移潜能亚系95C细胞的体外侵袭迁移能力的影响,初步探讨LASS2/TMSG-1基因的作用机制。方法采用蛋白质印迹法检测LASS2/TMSG-1在人不同转移潜能人肺癌细胞系95C(低转移潜能)和95D(高转移潜能)细胞中的表达情况。运用脂质体转染法将靶向沉默LASS2/TMSG-1基因的Psilencer2.1-U6/TMSG-1shRNA转染95C细胞(低转移潜能,LASS2/TMSG-1高表达),实验分为空白对照组(Normal)、无关阴性对照组(Control)及LASS2/TMSG-1基因沉默组(Silence)三组。应用体外侵袭实验、迁移实验检测细胞侵袭与迁移能力的变化;利用蛋白质印迹法检测LASS2/TMSG-1、ATP6L、MMP-2、MMP-9及Bcl-2在细胞中的表达水平及MMP-2的活性;使用比色法检测细胞中V-ATPase的活性;使用BCECF-AM与BCECF氢离子敏感探针检测细胞内外氢离子浓度的变化。结果 LASS2/TMSG-1在95C细胞系中的蛋白表达量(1.09±0.46)明显高于在95D细胞系中的表达(0.53±0.25),差异有统计学意义,z=1.925,P<0.05。转染LASS2/TMSG-1shRNA 48h后,Silence组LASS2/TMSG-1 mRNA表达量为0.76±0.03,Control组为1.56±0.10,Normal组为1.66±0.42,差异有统计学意义,H=10.56,P<0.05;Silence组LASS2/TMSG-1蛋白表达量为0.56±0.09,Control组为1.57±0.08,Normal组为1.66±0.08,差异有统计学意义,H=14.84,P<0.05。质粒瞬时转染48h后,体外侵袭实验显示,Silence组穿膜细胞数为50.67±6.74,Control组为25.33±10.21,Normal组为27.17±6.40,差异有统计学意义,H=11.39,P<0.05;体外迁移实验显示,Silence组穿膜细胞数为98.50±10.70,Control组为26.50±4.87,Normal组为30.25±7.81,差异有统计学意义,H=15.89,P<0.05。与Normal组及Control组相比,沉默组细胞V-ATPase的C亚基ATP6L的mRNA(z=2.31,P<0.05;z=2.46,P<0.05)及蛋白表达(z=2.62,P<0.05;z=2.61,P<0.05)升高,V-ATPase的活性(z=3.13,P<0.05;z=3.14,P<0.05)和细胞外氢离子浓度(P均<0.05)升高,而细胞内氢离子浓度与其他两组相比明显降低(P均<0.05);并且MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白的表达(P均<0.05)及MMP-2的活性升高(P=0.05)。结论 LASS2/TMSG-1是一种肿瘤转移抑制基因,可能参与抑制肺癌侵袭及转移过程。沉默LASS2/TMSG-1基因表达后,V-ATPase质子泵中关键性C亚基(ATP6L)的表达上升,且基因沉默后其V-ATPase活性增强、细胞内H+浓度下降及细胞外H+浓度上升,反向提示LASS2/TMSG-1可以通过结合ATP6L亚基抑制V-ATPase活性,从而改变细胞内外氢离子浓度,进而影响MMP-2、MMP-9的表达及MMP-2的活性,进而改变肿瘤细胞的侵袭迁移能力等生物学行为。该过程中,Bcl-2可能参与诱导了MMP-2及MMP-9的表达。

LASS2/TMSG1过表达抑制人肺癌A549细胞增殖和促进A549细胞凋亡:基于上调神经酰胺和p38 MAPK进而启动级联信号传导通路

目的探究人源性长寿保障基因2/肿瘤转移抑制相关基因1(LASS2/TMSG1)过表达对人肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响并探讨相关机制。方法对课题组先前构建好的人肺癌A549细胞阴性对照组和LASS2/TMSG1基因过表达组进行如下实验:Western blot检测LASS2/TMSG1蛋白表达水平,平板克隆形成实验、CCK-8法、Hoechst/PI双染、流式细胞术检测A549细胞体外增殖能力及凋亡情况。将14只裸鼠随机分为阴性对照组和LASS2/TMSG1基因过表达组,7只/组,分别向对应组别的裸鼠颈背部皮下注射A549细胞阴性对照组和LASS2/TMSG1过表达组细胞悬液,构建裸鼠移植瘤模型,检测LASS2/TMSG1基因过表达对A549细胞体内增殖能力的影响。Western blot检测A549细胞及裸鼠移植瘤中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达水平。ELISA法分析A549细胞上清液及裸鼠移植瘤组织匀浆中神经酰胺和p38 MAPK蛋白含量。结果与阴性对照组相比,LASS2/TMSG1基因过表达组A549细胞LASS2/TMSG1蛋白表达量显著升高(P<0.05),体外增殖能力下降(P<0.05),早期凋亡率上升(P<0.05),移植瘤细胞体内增殖受到抑制(P<0.05),A549细胞及裸鼠移植瘤中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达量均显著升高(P<0.05),A549细胞上清液及裸鼠移植瘤组织匀浆中神经酰胺和p38 MAPK含量显著增加(P<0.05)。结论LASS2/TMSG1基因过表达能显著抑制人肺癌A549细胞的体内、外增殖能力,促进肿瘤细胞早期凋亡,这可能与LASS2/TMSG1基因过表达后上调了神经酰胺及其下游的效应分子p38 MAPK蛋白进而启动级联信号传导通路有关。

肿瘤转移抑制基因LASS2/TMSG1 S248A突变体通过增加ATP6V0C表达促进前列腺癌的侵袭

目的:探讨LASS2/TMSG1及其突变体在前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭中的分子作用机制。方法:构建表达LASS2/TMSG1全长及其4个突变体的pc DNA3真核表达载体,并稳定转染到高转移潜能前列腺癌PC-3M-1E8细胞系中;采用q PCR和Western blot法鉴定稳定转染效果,并分析不同点突变体对LASS2/TMSG1和ATP6V0C表达量的影响;采用生长曲线测定、四甲基偶氮唑蓝(MTT)掺入实验、软琼脂集落形成实验、细胞划痕修复实验、Matrigel穿膜侵袭实验和流式细胞术研究LASS2/TMSG1及其4个点突变体的细胞生物学功能,并通过免疫双重荧光染色分析LASS2/TMSG1不同突变体和ATP6V0C的相互作用情况。结果:q PCR和Western blot检测显示LASS2/TMSG1 S248A组较LASS2/TMSG1野生型组ATP6V0C表达增加了3倍(P<0.05),且免疫双重荧光染色结果显示LASS2/TMSG1 S248A组ATP6V0C表达明显增加;与LASS2/TMSG1野生型组相比,LASS2/TMSG1 S248A组的细胞增殖能力、锚着不依赖生长能力、细胞迁移能力(细胞迁移率从35.3%±3.2%增加到70.3%±3%)和侵袭能力(穿膜细胞数从50.0±3.2增加到203.0±6.5)明显提高(P<0.05),G0/G1期比例增加(从51.0%增加到85.4%,P<0.05),但细胞凋亡率亦明显升高(从7%增加到15.1%,P<0.05)。结论:LASS2/TMSG1第248位丝氨酸突变为丙氨酸后(S248A)能促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,其分子机制可能是LASS2/TMSG S248A使ATP6V0C表达量增加,进而促进前列腺癌的侵袭,提示LASS2/TMSG1蛋白第248位丝氨酸是抑制前列腺癌侵袭的重要功能位点。

肿瘤转移抑制基因LASS2/TMSG1全长及其截短体对人前列腺癌细胞生物功能的影响

目的构建肿瘤转移抑制基因LASS2/TMSG1全长及其截短体质粒,探讨其对人前列腺癌细胞生长、迁移、侵袭等生物学功能的影响。方法构建LASS2/TMSG1基因全长以及3个截短体的慢病毒质粒(pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro),并将其稳定转染到人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8中,采用Western blot法鉴定稳定转染的效果;然后采用软琼脂集落形成实验、细胞划痕修复试验、Transwell体外侵袭实验等分析LASS2/TMSG1基因全长以及3个截短体对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8生物学功能的影响。结果LASS2/TMSG1蛋白和缺失Homeobox(Hox)结构域的截短蛋白,可以有效抑制PC-3M-1E8细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P均<0.001);缺失TLC结构域的LASS2/TMSG1蛋白则丧失抑制前列腺癌细胞生长的功能。结论LASS2/TMSG1蛋白的TLC结构域是抑制前列腺癌细胞生长的关键功能域。

非小细胞肺癌中LASS2/TMSG1的表达及其临床意义

目的探讨LASS2/TMSG1在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及与临床病理特征、预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测NSCLC和癌旁正常组织中LASS2/TMSG1蛋白的表达,分析其表达与NSCLC临床病理特征的关系,并进行术后随访。结果LASS2/TMSG1蛋白在NSCLC组织中的表达(21/87,24.13%)明显低于正常肺组织(15/25,60.00%)。LASS2/TMSG1在NSCLC组织中的表达与肿瘤分化、淋巴结转移呈负相关(P<0.05),且LASS2/TMSG1阳性患者的总生存期及无瘤生存期均明显高于LASS2/TMSG1阴性患者(P<0.05)。多因素Cox分析显示,LASS2/TMSG1是NSCLC患者的独立预后因素。结论LASS2/TMSG1可能抑制肺癌的发生、分化及转移,有望成为肺癌患者的预后指标之一。

线粒体途径参与LASS2/TMSG1基因诱导人肺癌95C细胞凋亡的机制

目的探讨LASS2/TMSG1对人肺癌95C细胞增殖和凋亡的影响及发病机制。方法采用RT-PCR、Western blot法检测LASS2/TMSG1在人不同转移潜能肺癌细胞系95C(低转移潜能)和95D(高转移潜能)中的表达。应用慢病毒转染法将靶向沉默LASS2/TMSG1基因的LV-CERS2-RNAi(30011-1)转染至95C细胞;流式细胞术及MTT检测肿瘤细胞的体外增殖和凋亡情况;倒置显微镜观察细胞常规培养下的状态,透射电镜观察细胞线粒体超微结构的变化;荧光显微镜结合JC-1染液观察细胞线粒体膜电位的变化;Western blot法检测细胞中LASS2/TMSG1、Akt3、P-Akt3、Bax、BCL-2的表达水平。结果LASS2/TMSG1在95C细胞中的mRNA(t=16.85,P=0.004)及蛋白表达水平(t=15.26,P=0.004)明显高于95D细胞;LASS2/TMSG1沉默后,95C细胞中LASS2/TMSG1 mRNA(F=164.053,P<0.001)和蛋白(F=18.293,P=0.003)的表达明显降低;流式细胞术检测LASS2/TMSG1基因沉默组细胞的凋亡率明显降低(F=17.340,P=0.003);MTT检测显示LASS2/TMSG1沉默组细胞从第4天(F=66.318,P<0.001)、第5天(F=224.582,P<0.001)开始,细胞增殖率明显增高;电镜和荧光显微镜观察发现,LASS2/TMSG1基因沉默,对线粒体膜电位水平的下降有干扰作用(F=14.687,P=0.005);P-Akt3蛋白(F=28.628,P<0.001)及BCL-2蛋白(F=6.049,P=0.036)表达水平升高;Akt3、Bax蛋白表达量无相关性。结论LASS2/TMSG1基因可能抑制V-ATPase活性,使细胞内H+浓度升高,线粒体膜电位降低,线粒体凋亡通路中的相关蛋白释放促进95C细胞凋亡。

LASS2基因对恶性肿瘤作用机制研究进展

人源性长寿保障基因Ⅱ型(LASS2)又名肿瘤转移抑制基因-1(TMSG1),是新发现的一种肿瘤转移抑制基因,多项研究表明其在肝癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结直肠癌、脑膜瘤、鼻咽癌等多种恶性肿瘤中表达下降,有研究显示LASS2对恶性肿瘤具有促进凋亡及抑制转移等抑癌基因的作用。本文就目前研究LASS2对不同恶性肿瘤的作用及其作用机制的进展作一综述。

沉默液泡型ATP酶c亚基ATP6V0C抑制人前列腺癌细胞侵袭的分子机制

目的:采用RNA干涉技术沉默液泡型ATP酶c亚基ATP6V0C的表达,探索ATP6V0C在前列腺癌侵袭中的分子作用机制,并研究其与LASS2/TMSG1的关系。方法与结果:ATP6V0C在高转移潜能人前列腺癌细胞系(PC-3M-1E8和PC-3M)中的表达明显高于低转移潜能人前列腺癌细胞系(PC-3M-2B4和PC-3),选择ATP6V0C表达量最高的PC-3M-1E8细胞进行基因沉默实验,发现ATP6V0C的siRNA转染PC-3M-1E8后,其基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotein-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达量及MMP-2的分泌量均无明显变化,但上清液中MMP-9的活性明显减弱,与空白对照组及阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);干扰组细胞外氢离子浓度及液泡型ATPase的活性明显降低(P<0.05);细胞划痕修复实验及transwell体外侵袭实验结果显示ATP6V0C siRNA干扰组细胞的体外迁移及侵袭能力明显减弱(P<0.05)。PC-3M-1E8细胞转染ATP6V0C siRNA后,LASS2/TMSG1的表达明显减弱(P<0.05)。免疫荧光双重染色结果显示ATP6V0C蛋白与LASS2/TMSG1共定位于胞浆和胞膜,干扰组共定位信号与对照组相比明显减弱。结论:特异性siRNA沉默ATP6V0C能抑制人前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力,其机制与ATP6V0C沉默后抑制V-ATPase的活性,使细胞外氢离子浓度降低,抑制MMP-9的激活,从而影响细胞外基质的降解和重塑有关。靶向siRNA干扰ATP6V0C的表达后,可能通过反馈调节机制抑制LASS2/TMSG1的表达,但其具体分子机制尚待进一步研究。