何首乌-牛膝药对抗维甲酸诱导骨质疏松作用及活性成分筛选研究

目的研究何首乌-牛膝药对的抗骨质疏松作用及筛选活性成分。方法采取液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用法分析何首乌-牛膝药对指纹共有峰并进行成分确认;采用维甲酸复制大鼠骨质疏松模型及酶联免疫吸附(ELISA)方法,探讨何首乌-牛膝药对的抗骨质疏松作用;应用SPSS分析色谱结果与肝、肾湿重、骨干湿比数据和ELISA测定结果的相关性筛选何首乌-牛膝药对抗骨质疏松活性成分。结果HPLC-MS联用法分析结果共确定10个共有指纹峰成分,分别为:没食子酸、杯苋甾酮、β-蜕皮甾酮、25-R-牛膝甾酮、二苯乙烯苷、25-S-牛膝甾酮、大黄素、大黄素甲醚、齐墩果酸-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、牛膝皂苷D。生物学指标测定结果表明何首乌-牛膝药对能使维甲酸所致骨质疏松大鼠血清骨碱性磷酸酶(BALP)和骨钙素(BGP-OCN)指标升高,抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)和血清I型胶原C端肽(CTX-1)降低;何首乌-牛膝药对组肝、肾指数明显下降,骨干湿比上升,体质量变化明显。结论何首乌-牛膝药对具有抗骨质疏松作用,筛选出作用最显著活性成分为没食子酸、β-蜕皮甾酮、大黄素和齐墩果酸-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

检测牛IL-4双抗体夹心ELISA方法的建立

为利用牛白细胞介素-4(BoIL-4)的特异性单克隆抗体(MAb)建立检测BoIL-4的双抗体夹心ELISA方法,以多种ELISA方法对7株抗BoIL-4的单抗进一步筛选,得到反应最佳的2株单抗8B7和4A10,以A9表达的重组BoIL-4为阻断剂的阻断ELISA试验中,表明这2株单抗也可识别所构建的细胞系A9表达的重组BoIL-4。以单抗8B7作为包被抗体,以标记了HRP的单抗4A10作为检测抗体建立的双抗体夹心ELISA方法可检测大肠埃希菌、毕赤酵母和Flp-In-293细胞系3种表达系统表达的重组BoIL-4,最低检测限分别为0.25、8和2 ng·mL^(-1),且对A9细胞系上清中表达的BoIL-4检测效果和特异性良好。该研究建立的BoIL-4双抗体夹心ELISA方法为深入研究BoIL-4、开发BoIL-4 ELISA检测试剂盒奠定了基础。

基于重组牛病毒性腹泻病毒囊膜糖蛋白E2的间接ELISA检测方法建立

为建立一种检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的间接ELISA方法,本试验将纯化后的重组BVDVE2蛋白作为抗原包被96孔酶标板,采用方阵滴定法优化间接ELISA的各项反应参数初步建立检测方法,并进一步分析了该方法的特异性、敏感性和重复性。确定的最佳ELISA反应条件如下:抗原包被浓度为1.5μg/mL,1:100稀释待检血清于37℃孵育1 h,1:6 000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG于37℃作用1 h,确定阴、阳性血清临界OD450 nm值分别为0.203和0.226。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,与商品化试剂盒的检测符合率达96%,该方法可以用于BVDV抗体的检测和试剂盒的进一步研制。

ELISA测定血清β-葡萄糖醛酸酶及临床应用

β－葡萄糖醛酸酶（β－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ，β－Ｇ）存在于人体的各种组织及体液中，当机体患有癌症或发生恶变时，该酶活性增高。我们应用ＥＬＩＳＡ法对血清β－Ｇ进行检测，判断其在良恶性疾病筛选和诊断中的价值。１材料与方法１．１样品选择肿瘤组１１１例...

应用重组信号蛋白14-3-3间接ELISA诊断日本血吸虫病

目的探讨重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)间接ELISA用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法表达并利用纯化的rSj14-3-3与成虫抗原(SjAWA)间接ELISA法分别检测51份急性和49份慢性日本血吸虫病患者和50份正常人血清,以上血清标本同时用SEA致敏的间接血凝试验(SEA-IHA)检测。再以3种方法检测30份华支睾吸虫感染者、24份卫氏并殖吸虫感染者和31份钩虫感染者血清,分析其交叉反应性。结果51份急性和49份慢性血吸虫病患者血清的rSj14-3-3抗体阳性率分别为98.0%和91.8%;SjAWA的检出率分别为96.1%和90.0%;IHA的阳性率分别为98.0%和93.9%。经统计学分析,以上结果无显著性差异(P>0.05)。Sj14-3-3间接ELISA、SjAWA间接ELISA和SEA-IHA对于30份华支睾吸虫感染者的交叉反应性分别为13.3%、20.0%和16.7%,24份卫氏并殖吸虫感染者分别为8.3%、12.5%和12.5%,31份钩虫感染者分别为12.9%、16.1%和12.9%。经统计学分析结果也无显著性差异(P>0.05)。结论rSj14-3-3抗原间接ELISA法诊断日本血吸虫病,具有高度的敏感性和特异性,可用于血吸虫病的免疫诊断。

牛乳过敏原β-乳球蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立

检测牛乳中的主要过敏原β-乳球蛋白,利用β-乳球蛋白纯品免疫新西兰白兔,制得兔抗牛β-乳球蛋白的多克隆抗体,以β-乳球蛋白包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗、四甲基联苯胺（TMB）为底物,建立了牛乳中β-乳球蛋白的间接竞争酶联免疫检测法（ELISA）。确定了包被抗原质量浓度为0.5μg/mL,一抗最佳稀释度为1∶6 400,酶标二抗稀释度为1∶10 000。结果达到批内误差3.87%,批间误差6.51%;检测的线性范围为0.05～1.00μg/mL,标准曲线回归方程y=-1.930 2x-0.124 1,相关系数为0.994 5,说明所建立的方法灵敏度高,具有良好的准确性和重复性。

牛γ-干扰素ELISA检测方法的建立与初步应用

以纯化的rHis-BoIFN-γ制备兔多抗血清,辛酸—硫酸铵两步法对体内诱生的抗rBoIFN-γ单抗腹水进行纯化,用美洲商陆素(Pokeweed mitogen,PWM)刺激奶牛全血产生的分泌性天然BoIFN-γ筛选出与之反应最佳的单抗5E11。将单抗5E11以40μg/mL浓度包被,与1∶3 000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清(13.8μg/mL)配对,以1∶6 000稀释的商品化酶标羊抗兔IgG为指示抗体,建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法,该方法可以检出2.56 U/100μL(30.5 pg/100μL)的rHis-BoIFN-γ、8U/100μL的rBac-BoIFN-γ和1U/100μL的分泌性天然BoIFN-γ。以商品化试剂盒作为平行对照,将获得的奶牛临床检测血浆样品使用BoIFN-γ抗原捕获ELISA法进行检测,结果显示两种方法检测符合率达到83.9%。本研究建立的BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法可有效检测分泌性IFN-γ,为进一步开发BoIFN-γELISA检测试剂盒奠定了基础。

γ-干扰素ELISA检测方法在广西牛结核病流行病学调查中的应用

【目的】摸清广西水牛及奶牛结核病的流行情况，为制定净化广西牛结核病防制策略提供参考。【方法】2008～2011年采用皮内变态反应和γ-干扰素ELISA检测方法联合对广西奶牛及水牛开展结核病流行病学调查，共检疫5478头奶牛和1580头奶水牛。【结果】2008～2011年从广西南宁、柳州、北海、钦州、桂林等市累积检测出皮内变态反应阳性奶牛63头、水牛17头，阳性检出率分别为1.15％和1.08％，总体上广西奶牛及水牛结核病阳性率呈现逐年降低的趋势。通过采用自制水γ－干扰素EusA检测试剂盒和Bovigam牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒对牛结核病进行检测，发现γ-干扰素ELISA检测的牛结核病阳性率低于皮内变态反应，且准确度高。【结论】对牛群进行结核病检测时，先以变态反应检疫牛群，再结合γ-干扰素ELISA检测进行综合判断，更有利于牛结核病的检测与净化。

ELISA检测老年期痴呆脑脊液淀粉样蛋白β_(1-42)

研究了阿尔茨海默病 (Alzheimer′sdisease ,AD)和血管性痴呆 (vasculardementia ,VD)患者脑脊液中淀粉样蛋白(Aβ1-4 2 )的含量并探讨其意义。采用酶联免疫吸附法检测 2 4例AD患者、 14例VD患者及 30例正常对照者脑脊液中Aβ1-4 2的浓度。结果AD患者和VD患者脑脊液中Aβ1-4 2 水平明显低于正常对照组。Aβ1-4 2 值用于诊断老年期痴呆 ,具有一定的特异性和敏感性 。

间接竞争ELISA法检测牛乳中β-乳球蛋白含量的准确性评价

研究建立了以β-乳球蛋白标准品为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG:HRP为二抗、邻苯二胺为底物的间接竞争酶联免疫检测法(indirect competitive enzyme-linked immu nosorbent,ELISA)。同时以反相高效液相色谱法定量检测相同样品中β-乳球蛋白含量,采用t检验方法来评价间接竞争ELISA的方法定量检测β-乳球蛋白的准确性。t检验方法结果显示:在显著水平α=0.05下,该间接竞争ELISA法检测β-乳球蛋白的测量值较为准确。

夹心ELISA法快速检测肝病患者血清中金属蛋白酶组织抑制剂-1

目的建立一种快速检测肝病患者血清基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的双抗体夹心ELISA,了解血清TIMP-1的水平与肝纤维化病程进展程度的关系。方法以不同浓度的抗人TIMP-1单克隆抗体(mAb)为包被抗体,加入待测抗原以及辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗TIMP-1mAb作为标记抗体进行方阵滴定,建立双抗体夹心ELISA,并用于临床检测408例肝病患者血清TIMP-1的水平。结果方阵滴定的结果表明包被抗体浓度为1mg/L,血清稀释倍数1∶100,HRP标记mAb的最佳工作浓度为1∶400。以此条件建立的夹心ELISA法具有良好的可重复性,中和抑制率在85%以上,稳定性良好,与国外检测TIMP-1的ELISA试剂盒进行对比试验,具有良好的相关性(r=0.988)。用于临床快速检测肝硬化的检出阳性率为76.4%,明显高于慢性肝炎(40.2%)和急性肝炎(19.5%,P<0.005),并随着患者肝纤维化程度的加重而升高(P<0.001)。结论血清TIMP-1水平的变化可作为诊断肝纤维化良好指标。本法简便、快速,敏感性高、特异性强,用于肝纤维化的人血清学快速诊断。尤其适于医院及基层医疗单位应用。

光谱法研究入-4-(十六烷氧基)双酞菁镧的LB膜

测定了八－４－（十六烷氧基）双酞菁镧氯仿溶液在亚相水面上的π～Ａ曲线，同时制备了它的ＬＢ膜。

β2-受体激动剂类药物多残留间接竞争ELISA检测方法的建立

【目的】建立β2-受体激动剂类药物多残留间接竞争ELISA检测方法,为动物食源性β2-受体激动剂类药物残留的快速检测提供技术支持。【方法】以沙丁胺醇多克隆抗体为基础,优化间接竞争ELISA的检测条件,建立一种快速检测猪尿中沙丁胺醇、卡布特罗、西布特罗、克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、克伦潘特、可尔特罗、吡布特罗、马喷特罗、比托特罗与妥布特罗等12种β2-受体激动剂类药物的间接竞争ELISA检测方法。【结果】建立的β2-受体激动剂类药物间接竞争ELISA检测方法的最佳反应条件为:37℃,抗原以1∶10000倍包被1 h,抗体以1∶40000稀释作用40 min,酶标抗体以1∶20000稀释作用40 min。采用建立的间接竞争ELISA最佳反应条件对猪尿中的β2-受体激动剂类药物残留进行检测,结果表明12种β2-受体激动剂类药物在0.1~20μg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.952;检出限为0.15μg/L,定量限为0.5μg/L;在0.5与1.0μg/L的添加浓度下,回收率为68.4%~114.2%,批内、批间RSD分别为0.4%~10.1%和0.4%~12.5%。【结论】所建立的β2-受体激动剂类药物残留ELISA检测方法操作简单、快速,灵敏度高,适用于猪尿中β2-受体激动剂药物的筛选与检测。

双抗体夹心ELISA法测定猪α-干扰素的浓度

为了能够准确测定猪血清中猪α-干扰素（Po IFN-α）含量及猪α-干扰素制品的浓度,本研究以制备并经过亲和层析提纯的兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆抗体为包被抗体,以制备的鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作为二抗,建立了测定猪α-干扰素浓度的双抗体夹心ELISA法（DAS-ELISA）。通过条件优化,最佳兔抗猪α-干扰素Ig G多克隆纯化抗体包被浓度为12.5μg·m L^-1,最佳鼠抗猪α-干扰素单克隆纯化抗体作用浓度为6.25μg·m L^-1,利用本实验室制备的已知浓度猪α-干扰素标准蛋白建立标准曲线,确定该方法检测猪α-干扰素浓度范围为0.0781-2.50μg·m L^-1。与Lowry法、冻干称量法测定猪α-干扰素浓度相比较,3种方法检测结果无显著差异,但所建立的双抗体夹心ELISA法能够检测血清中猪α-干扰素浓度,且方法简便。

检测马白细胞介素-18双抗体夹心ELISA方法的建立

目的:建立检测马白细胞介素-18(equine interleu-kin-18,EIL-18)的双抗体夹心ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法。方法:将识别不同表位的EIL-18的2株单克隆抗体(mAb)B1G1和S6A3纯化后,利用生物素标记试剂盒对B1G1株mAb进行标记,以重组马白细胞介素-18(rEIL-18)为捕获抗原进行ELISA检测来建立EIL-18双抗体夹心ELISA。结果:经过方阵滴定试验确定捕获抗体的最佳浓度为4mg/L,检测抗体的工作效价为1∶2000。建立的方法可检测马血清中的EIL-18,与猪、牛和羊血清中的IL-18不发生交叉性反应,此方法检测敏感度达到15ng/L,特异性良好。结论:成功建立了EIL-18的双抗体夹心ELISA,为马细胞免疫学研究提供了方法,也为下一步EIL-18ELISA试剂盒的商品化开发奠定了坚实基础。

ELISA测定蜂王浆中10-羟基-α-癸烯酸

将 1 0 羟基 α 癸烯酸 ( 1 0 HDA)结构中原有的羧基酯化加以保护 ,再将 1 0 HDA另一端的羟基与琥珀酸酐反应引进一个带有羧基的“桥”。应用混合酸酐法 ,通过“桥”将 1 0 HDA与载体蛋白偶联制备成人工合成抗原 ,并以此为免疫原 ,免疫兔获得特异性抗血清。经间接酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定其终点滴度大于 1∶32 7680。抑制试验表明其检测范围在 7 81 2～ 2 5 0 μg/g之间 ,可用于出口蜂王浆中 1 0 HDA的含量检测。经对 2 0个样品进行检测 ,与液相色谱法检测结果的符合率为 91 %～ 1 0 0 % ,平均为 95 0 3% ,回收试验平均回收率为 88 3%。以 5个样品各测定 7次 ,计算其批间误差为 5 9%～ 8 0 % ,平均为 6 5 0 %。

ELISA法检测IgA肾病患者血清β_2-GPI/LDL复合物

目的建立人血清β2-糖蛋白Ⅰ/低密度脂蛋白(β2-GPI/LDL)复合物ELISA检测法,探讨其对IgA肾病的诊断价值。方法建立以抗人β2-GPI抗体为包被抗体、酶标记抗apoB为检测抗体的β2-GPI/LDL ELISA检测法,对50例IgA肾病患者和50例健康对照者检测分析。结果建立的β2-GPI/LDL ELISA检测法灵敏度0.25 U/m l,批内、批间变异系数为5.73%和10.67%,参考范围(0.66±0.17)U/m l。IgA肾病组β2-GPI/LDL水平显著高于对照组[(1.27±0.23)U/m l vs(0.66±0.17)U/m l,P<0.0001]。敏感性86%,特异性为100%。结论β2-GPI/LDL以健康对照组x-+2s即1.0 U/m l为cut off值,对IgA肾病有较高的敏感性与特异性,提示其有潜在的临床诊断价值。

ELISA方法测定尿8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)含量及其临床意义

〔目的〕介绍测定尿8-羟基脱氧鸟苷（8-OH-dG）含量的ELISA方法。〔方法〕利用8-OH-dG特异性单克隆抗体试剂盒,结合酶标仪进行定量测定。〔结果〕尿样测定值的批间和批间相对标准偏差分别为5.8l％～9 35％和6.42％～10.11％;同一个体一天中不同时点尿样的8-OH～dG含量之间没有显著性差异;80例健康志愿者的尿8-OH-dG含量为14,15±9.00ng/mgCr。其中男性为11.85±5.72ng/mgCr,女性为16.24±10.83ng/mgCr,女性的尿8-OH-dG含量明显高于男性;健康男性和女性尿8-OH-dG含量的95％参考值范围分别为0～25.77ng/mgCr和0～44.89ng/mgCr。〔结论〕应用ELISA试剂盒法可以简单灵敏、准确地测定尿8-OH-dG含量。

8-羟基喹啉镧两亲性配合物LB膜的双层电致发光器件

以具有不同层数的两亲配合物二 [2 -( N -十六烷基氨基甲酰基 ) -8-羟基喹啉 ]合镧 [La( HQ) 2 Cl]的 LB膜为发光层 ,PBD为电子传输层 ,制备了双层结构的电致发光 ( EL)器件 :ITO/LB膜 /PBD/Al.器件产生黄绿色注入式发光 .LB膜的层数和沉积压对器件的性能具有重要影响 .在 1 6V激发电压下 ,5 ,1 1和 2 1层LB膜双层 EL器件的电流密度分别为 4 8,2 9和 1 6.4 m A/cm2 ,启亮电压阀值为 7.5 ,8.5和 9.5 V.器件的亮度随电流密度和驱动电压的增加而增加 .在相同偏压下 ,2 1层 LB膜 EL器件的亮度大于 5和 1 1层 LB膜的器件 .在 2 5 m N/m沉积的 LB膜制备的 EL器件具有较高的亮度 ( 1 2 1 9cd/m2 )和击穿电压 .

竞争ELISA法对牛乳β-酪蛋白的检测

通过确定包被抗体最佳稀释度(anti-β-CN IgY1:160)、封闭液及封闭时间(含1%明胶的PBST,封闭1h)、酶标抗原(1:20)和待测脱脂牛乳样品稀释液(1:80)抗体作用时间(60min)、底物最佳反应时间(20min)、温度(37℃)等对竞争ELISA效果有重要影响的因素,建立检测牛乳β-酪蛋白的竞争ELISA法。经敏感性实验和重复性实验证明本实验建立的竞争ELISA法最低检出量为5.1μg/mL,变异系数(CV)小于5%,可以开发应用于牛乳及其制品的蛋白质品质快速检测。