“普薯32号”中LCYb基因的克隆与序列分析

作为我国的一种重要粮食作物,甘薯在抵抗饥荒、保障粮食安全方面发挥着重要作用。近年来,对甘薯的营养和保健功效的研究越来越多,许多以甘薯为原料的新型食品被开发出来。β-胡萝卜素是甘薯中一种重要的生物活性物质,能够转化为维生素A,维持人类眼睛和皮肤的健康,从而改善夜盲症、皮肤粗糙的状况。番茄红素β-环化酶(LCYb)是参与β-胡萝卜素合成的关键酶。本研究从橘肉甘薯品种“普薯32号”中分离得到IbLCYb基因,并对其进行序列分析和编码蛋白的理化性质分析等。结果表明:IbLCYb基因的开放阅读框长度为1506 bp,编码501个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量为56.45kDa,理论等电点为8.02,属于亲水性非跨膜蛋白。系统进化分析结果表明:甘薯LCYb与三裂叶薯LCYb的亲缘关系最近。这些结果为进一步研究甘薯LCYb的功能以及调控β-胡萝卜素合成的机制提供理论基础。

黄秋葵番茄红素β-环化酶LCYB基因的克隆与分析

应用RT-PCR和RACE技术克隆得到cDNA全长1797 bp的黄秋葵(Hibiscus esculentus L.)番茄红素β-环化酶基因LCYB,开放阅读框(ORF)包含1509个碱基;预测编码503个氨基酸,理论分子量(Mw)为56.288 kD,等电点(p I)为4.577;编码的蛋白与陆地棉(Gossypium hirsutum L.)、黄麻(Corchorus capsularis L.)和可可(Theobroma cacao L.)同源蛋白的相似性均在88%以上,显示其高度的保守性,将基因命名为HeLCYB,GenBank登录号为:KX257998。Motif Scan分析显示,蛋白氨基酸序列88~481位为HeLCYB保守结构域,并在88~113位含有1个FAD结合域。通过荧光定量PCR分析表明,HeLCYB基因在黄秋葵根、茎、叶、花和果荚中均有表达;叶片生长中以成熟叶中表达最高,果实发育中以花后7d高表达。建立与优化了黄秋葵类胡萝卜素超高效液相检测体系,结果显示黄秋葵中主要含有β-胡萝卜素和叶黄素。β-胡萝卜素在成熟叶中含量最高,果实以花后7 d含量最高,与HeLCYB基因的表达呈正相关。本研究揭示了HeLCYB基因表达和类胡萝卜素积累的特性,为开展黄秋葵类胡萝卜素分子调控机制研究奠定了基础。

番茄红素β-环化酶基因(LcyB)启动子调控LcyB RNAi双元载体构建

根据番茄基因组DNA序列信息设计引物进行PCR扩增了Micro-Tom中番茄红素β-环化酶(Lycopeneβ-cyclase,Lcy B)基因起始密码子上游1 534 bp启动子区域序列(Lcy Bp),生物信息学分析表明,该启动子序列中存在TATA-盒、CAAT-盒、昼夜节律响应元件Circadian、光响应元件Box I、真菌激发子响应元件Box-W1、低温响应元件LTR、响应赤霉素的作用元件P-box、乙烯响应元件ERE、响应生长素的作用元件TGA-element等顺式作用元件.依据番茄Lcy B基因序列,设计2对含有不同酶切位点的特异引物进行PCR扩增Lcy B基因3’端特异的276 bp DNA片段,利用RNAi载体p KANNIBAL构建了"Lcy B启动子-Lcy B基因正义片段(Sense)-PDK内含子-Lcy B基因反义片段(Antisense)-OCS终止子"的RNAi表达框,并将这一RNAi表达框插入植物双元表达载体p ART27的Not I位点,构建成本研究的Lcy B启动子驱动的Lcy B基因RNAi植物双元表达载体p ART-Lcy Bp-RNAi-Lcy B.为利用RNAi技术特异性敲除Lcy B基因进而提高番茄果实中番茄红素含量奠定实验基础.

Lcyb基因与辣椒红素合成的关系

β-胡萝卜素是辣椒红素的上游物质,Lcyb基因是调控β-胡萝卜素合成的一个关键酶基因,Lcyb基因与辣椒红素合成到底存在怎样的调控关系有待进一步研究。本文通过构建烟草脆裂病毒载体,运用VIGS技术敲除Lcyb基因,同时运用HPLC技术测定辣椒红素的含量,探讨Lcyb基因与辣椒红素合成的关系。结果表明,Lcyb基因敲除后不仅辣椒果色发生了变化,辣椒红素含量也大幅度的降低,表明Lcyb基因与辣椒红素的合成存在着一定的调控关系。

桂花OfLCYB和OfLCYE启动子的克隆和活性分析

番茄红素环化是类胡萝卜素合成过程中的重要分支点,植物中存在两种番茄红素环化酶LCYB和LCYE。前期研究发现,OfLCYB1、OfLCYE1等基因的差异表达决定了桂花不同品种中类胡萝卜素代谢分支下游产物的含量不同。以‘堰虹桂’基因组DNA为模板,通过染色体步移的方法(Genome walking)克隆出OfLCYB和OfLCYE启动子分别为1 028 bp和904 bp。通过生物信息学分析发现两个启动子序列包含TATA-box、CAAT-box等基本元件,同时都含有水杨酸响应元件TCA-element,以及一些光响应元件如Sp1、ACE、Box4、G-box等;OfLCYB启动子还包括脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件P-box,OfLCYE启动子包括赤霉素响应元件GARE-motif及热击响应元件HSE。将克隆到的启动子片段与p BI121载体进行重组,构建植物表达载体并转入农杆菌,采用叶盘法侵染烟草叶片进行瞬时表达。结果表明,OfLCYB和OfLCYE启动子片段均具有驱动下游报告基因表达的功能。

TeLCYB基因的番茄遗传转化分析

万寿菊(Tagetes erecta L.)中含有类胡萝卜素,不仅可用于天然色素提取,还是研究类胡萝卜素合成代谢的植物材料。番茄红素β-环化酶(lycopene beta cyclase,LCYB)是类胡萝卜素合成代谢途径中的一个关键酶,文章通过对万寿菊中TeLCYB基因克隆、植物表达载体构建、并利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,获取TeLCYB基因转化番茄植株。分子鉴定和表型分析结果表明,万寿菊TeLCYB基因在番茄中表达,并改变转基因番茄果实颜色。高效液相色谱测定显示,TeLCYB基因的表达显著增加了番茄果实中β-胡萝卜素的量。该文研究结果表明TeLCYB基因具有功能活性,可用于改良植物果实的色素营养品质。

鸡爪槭ZDS和LCYB基因的克隆及其表达分析

为了解槭树叶片呈色的基因调控机理,本研究采取RT-PCR技术,以鸡爪槭‘黄金槭’叶片为材料,克隆得到ZDS基因和LCYB基因的c DNA序列,其在GenBank中的登录号分别为MF289487.1和MF289490.1。ZDS基因cDNA序列长1 902 bp,有一个1 707 bp的完整开放阅读框,共编码568个氨基酸。LCYB基因cDNA序列长1 745 bp,有一个1 527 bp的完整开放阅读框,共编码508个氨基酸。生物信息学分析表明:ZDS和LCYB蛋白质均为亲水性蛋白质,无信号肽和跨膜结构。进化树结果显示‘黄金槭’ZDS与番木瓜的亲缘关系较近,‘黄金槭’LCYB与甜橙和柚子的亲缘关系较近。定量分析结果显示,在不同叶色品种比较中,ZDS和LCYB基因均在黄色系品种‘黄金槭’中相对表达量较高;在不同时期比较中,ZDS和LCYB基因均在呈色期表达量最高;说明这2个基因在槭树黄色叶片发育过程中具有重要作用。

矮牵牛PhLcyB基因的克隆及功能分析

本研究以矮牵牛为实验材料,利用VIGS技术验证矮牵牛类胡萝卜素代谢途径关键酶基因PhLcyB的功能,为探究植物叶片中类胡萝卜素的代谢调控的分子机制及类胡萝卜素在叶片呈色方面的作用机理提供理论依据。本实验克隆获得了PhLcyB基因的完整ORF序列,通过VIGS技术构建了TRV-PhLcyB和TRV-PhCHS重组载体,通过侵染发现TRV-PhLcyB侵染的的矮牵牛植株叶片出现大面积白化现象,花瓣颜色没有明显变化。进行叶片生化检测后,发现PhLcyB基因沉默后叶片中类胡萝卜素含量明显降低,尤其是叶黄素降低明显,同时叶片中叶绿素a和叶绿素b含量明显降低。PhLcyB基因对矮牵牛叶片中类胡萝卜素(尤其是叶黄素)的代谢调节有重要作用。

‘三红蜜柚’果实类胡萝卜素合成途径部分酶基因的克隆及表达分析

果实颜色是柚(Citrusmaxima)的重要性状之一,为了解其色泽调控机理,本研究以‘三红蜜柚’为材料,从柚转录组数据库(未发表)中筛选得到CmPSY、CmPDS、CmZDS和CmLCYB的序列,分别编码438、533、570、214个氨基酸。生物信息学表明,CmPSY、CmPDS、CmZDS和CmLCYB编码的氨基酸序列与可可树、木薯和甜橙的同源相似度较高,尤其是与甜橙的同源性分别高达97.95%、99.81%、97.89%和100%。实时荧光定量PCR检测结果表明,CmPSY、CmPDS、CmZDS和CmLCYB在蜜柚的汁胞、囊衣和海绵层中均有表达,且表达量基本都呈先增后降的趋势,说明这些基因在蜜柚类胡萝卜素代谢中不可或缺。4个基因表达水平基本都在花后150～180 d达到最大,说明这些基因之间有着密切的协作关系。本研究为类胡萝卜素在蜜柚果实各个组织的调控提供了研究信息,并为进一步通过基因调控来提高蜜柚的外观品质奠定了基础。

色素万寿菊中叶黄素合成相关基因的表达分析

本项研究以生产中用于杂交制种的8个色素万寿菊品种资源的花蕾期(Ⅰ)、鲜花半开期(Ⅱ)、鲜花盛开期(Ⅲ)的花瓣以及盛开期时的叶子(Ⅳ)为材料,采用实时荧光定量PCR方法,检测了叶黄素合成过程中3个相关基因lcyb(lycopene b-cyclase)、lcye(lycopene e-cyclase)和zds(ζ-carotene desaturase)在8个供试品种的不同发育时期的相对表达量。结果表明:3个基因的表达量在叶片中依次为lcyb>zds>lcye,花瓣中依次为lcye>zds>lcyb。lcye在花瓣中的表达量随花瓣的开放程度呈现先升高后降低的趋势,并在Ⅱ期达到最大值,且均高于叶片中lcye的表达量。Zds的表达趋势为Ⅱ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅲ。Lcyb在叶中的表达高于花瓣中的任何时期。父本花瓣Ⅲ期的lcye表达量高于其他品种,且它的叶片中的lcyb的表达也高于其它品种。本项研究结果将有助于进一步阐明lcyb、lcye和zds基因与色素万寿菊叶黄素合成积累之间的关系,为进行色素万寿菊的基因工程育种奠定基础。

桃果实番茄红素β-环化酶基因的克隆及表达分析

以黄肉品种桃果实‘金丽’为试验材料,利用同源序列克隆技术获得桃果实番茄红素β-环化酶(LCYb)基因的全长核苷酸序列,命名为PpLCYb。PpLCYb全长1 699bp,编码区长度1 515bp,编码504个氨基酸。进化树分析发现PpLCYb与草莓FaLCYb亲缘性较高。氨基酸序列分析表明PpLCYb含有特征序列LYAMPF及NAD(P)/FAD结合区,属于SDR超级家族。实时荧光定量PCR结果显示PpLCYb基因在桃果实中的表达总体呈现上升的趋势,并在果实处于硬熟期时达到较大值,随后在完熟期略有下降。桃果实PpLCYb基因的克隆及表达分析可为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机制奠定良好的基础。