甜玉米类胡萝卜素合成关键基因PSY1、LCYE和CrtRB1的功能分析

【目的】鉴定玉米类胡萝卜素合成关键基因PSY1、LCYE和CrtRB1的功能标记在47份甜玉米骨干自交系中的多态性和对类胡萝卜素各组分含量的影响,为了解玉米类胡萝卜素合成关键基因的功能及维生素A源强化育种提供参考和依据.【方法】以47份甜玉米骨干自交系为材料,用高效液相色谱法检测籽粒乳熟期类胡萝卜素各组分的含量,合成基因PSY1、LCYE和CrtRB1的6个功能标记并在47份甜玉米自交系中检测其基因型,结合基因型和类胡萝卜素各组分的含量,检测3个关键基因的单倍型效应,并分析联合单倍型效应.【结果和结论】除CrtRB1基因的标记Indel4未检出多态性,其余标记均检测出多态性.PSY1的Indel1和Indel4组成的单倍型可解释玉米黄质和总类胡萝卜素含量表型变异的14.81%和13.00%,LCYE的5'Indel和3'Indel位点分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜素含量表型变异的15.77%、20.75%和15.92%,CrtRB1的标记3'TE未检测出显著性.基因PSY1、LCYE和CrtRB1组成的联合单倍型分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜素含量表型变异的37.20%、40.71%和41.11%.基因间联合单倍型效应高于单基因单倍型效应.PSY1和LCYE有利等位基因对甜玉米中类胡萝卜素的合成有重要影响,其功能标记可用于分子标记辅助选择,为甜玉米的维生素A源强化育种奠定了基础.

甜玉米 LCYE 等位基因多态性及功能分析

【目的】鉴定甜玉米材料中LCYE基因的多态性和β-胡萝卜素和类胡萝卜素含量的变异,为了解甜玉米LCYE基因的等位基因功能及维生素A源强化育种提供参考和依据.【方法】以47份甜玉米自交系为材料,用高效液相色谱法检测β-胡萝卜素和总类胡萝卜素的含量,扩增LCYE基因并测序,结合LCYE基因的测序结果和β-胡萝卜素、总类胡萝卜素含量的表型值作关联分析.【结果和结论】在47份甜玉米自交系的LCYE基因的测序结果中共发现75个多态性位点,其中49个多态性位点分布在非编码区,26个多态性位点分布于LCYE基因的外显子区,且均为SNP,第5外显子区多态性位点最丰富,第4和第9外显子区未检测到多态性位点,其保守程度较高.关联分析检测到与β-胡萝卜素相关联的位点3个,与总类胡萝卜素含量关联的位点6个,位点exon1-2和exon5-6与2种表型极显著相关.本研究证明在甜玉米中LCYE基因与β-胡萝卜素和类胡萝卜素的合成显著相关,为甜玉米的维生素A源强化育种提供了理论基础.

中国水仙NtBCH基因的克隆及LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体的构建

参考洋水仙BCH基因设计引物,以中国水仙花瓣cDNA为模板克隆出中国水仙NtBCH基因,全长959 bp,编码303个氨基酸。以中国水仙LCYE和BCH为目的基因,利用pKANNBIAL、pBI121和pCAMBIA1301等载体构建了LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体,为利用基因工程技术改良中国水仙奠定了基础。

桂花OfLCYB和OfLCYE启动子的克隆和活性分析

番茄红素环化是类胡萝卜素合成过程中的重要分支点,植物中存在两种番茄红素环化酶LCYB和LCYE。前期研究发现,OfLCYB1、OfLCYE1等基因的差异表达决定了桂花不同品种中类胡萝卜素代谢分支下游产物的含量不同。以‘堰虹桂’基因组DNA为模板,通过染色体步移的方法(Genome walking)克隆出OfLCYB和OfLCYE启动子分别为1 028 bp和904 bp。通过生物信息学分析发现两个启动子序列包含TATA-box、CAAT-box等基本元件,同时都含有水杨酸响应元件TCA-element,以及一些光响应元件如Sp1、ACE、Box4、G-box等;OfLCYB启动子还包括脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件P-box,OfLCYE启动子包括赤霉素响应元件GARE-motif及热击响应元件HSE。将克隆到的启动子片段与p BI121载体进行重组,构建植物表达载体并转入农杆菌,采用叶盘法侵染烟草叶片进行瞬时表达。结果表明,OfLCYB和OfLCYE启动子片段均具有驱动下游报告基因表达的功能。

黄皮西葫芦类胡萝卜素合成酶基因的鉴定及PSY1和LCYE2克隆分析

类胡萝卜素是自然界中分布最为广泛的一大类色素,赋予植物花、果实等器官鲜艳的色彩,其合成过程中含有多种代谢酶基因。为了揭示黄皮西葫芦类胡萝卜素积累的分子机制,为进一步研究西葫芦类胡萝卜素合成酶基因的功能奠定基础,首先基于西葫芦基因组数据库对西葫芦类胡萝卜素合成代谢家族基因进行全基因组鉴定;进一步利用已公开发表的相关转录组数据筛选、qRT-PCR验证并克隆类胡萝卜素合成代谢关键酶基因。结果表明,在西葫芦基因组数据库中共发现48个类胡萝卜素代谢酶基因成员;根据Sweet REBA和Lady Godiva这2种不同颜色果皮材料不同发育时期果肉的转录组数据筛选出类胡萝卜素关键酶基因PSY1和LCYE2等在不同颜色果实发育时期存在显著性差异表达。qRT-PCR定量分析结果显示,除PSY1基因0 d和LCYE2基因2 d外,PSY1、LCYE2基因在黄皮西葫芦不同发育时期果皮中的相对表达量显著高于白皮西葫芦对应时期。对白皮西葫芦和黄皮西葫芦果皮PSY1和LCYE2等基因的全长CDS分别进行克隆、测序分析发现,白皮西葫芦和黄皮西葫芦2个材料的PSY1基因均比西葫芦参考基因组预测编码区序列多了一个51 bp的外显子,与已经公开的PSY基因序列(GenBank登录号:XM_023695146.1)一致;而LCYE2基因均与参考基因组无显著差异。系统进化树分析也表明,西葫芦PSY1与克隆报道的中国南瓜PSY(JN176311.1)同源,相似性高达98.80%。

色素万寿菊中叶黄素合成相关基因的表达分析

本项研究以生产中用于杂交制种的8个色素万寿菊品种资源的花蕾期(Ⅰ)、鲜花半开期(Ⅱ)、鲜花盛开期(Ⅲ)的花瓣以及盛开期时的叶子(Ⅳ)为材料,采用实时荧光定量PCR方法,检测了叶黄素合成过程中3个相关基因lcyb(lycopene b-cyclase)、lcye(lycopene e-cyclase)和zds(ζ-carotene desaturase)在8个供试品种的不同发育时期的相对表达量。结果表明:3个基因的表达量在叶片中依次为lcyb>zds>lcye,花瓣中依次为lcye>zds>lcyb。lcye在花瓣中的表达量随花瓣的开放程度呈现先升高后降低的趋势,并在Ⅱ期达到最大值,且均高于叶片中lcye的表达量。Zds的表达趋势为Ⅱ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅲ。Lcyb在叶中的表达高于花瓣中的任何时期。父本花瓣Ⅲ期的lcye表达量高于其他品种,且它的叶片中的lcyb的表达也高于其它品种。本项研究结果将有助于进一步阐明lcyb、lcye和zds基因与色素万寿菊叶黄素合成积累之间的关系,为进行色素万寿菊的基因工程育种奠定基础。

番茄红素ε-环化酶果实特异性RNAi载体的构建及对番茄的遗传转化

为了研究番茄LCYE基因对其果实中番茄红素含量的影响机制,培育高品质番茄品种,在Gen Bank中根据已知的LCYE(ID:544 129)扩增出337 bp的保守序列;根据KJ 561 284.1扩增出2 203 bp的果实特异性启动子E8;查找番茄LCYE的内含子,选择第三个长112 bp的Intron片段;利用同尾酶构建出载体p Ri E8-LCYE,与p CAMBIA1301连接构建出果实特异性RNAi表达载体p CRi E8-LCYE,测序表明载体构建正确。农杆菌介导,叶盘法转化番茄,PCR检测表明得到了转基因番茄植株。与同样条件下番茄LCYB基因干扰载体的遗传转化过程相比,表明:对LCYE基因的干扰使番茄子叶开始褐化时间提前,且褐化率更高,说明筛选培养时子叶的褐化与所干扰的基因也有关系。

原壳小球藻番茄红素ε环化酶基因的克隆和分析

【目的】番茄红素ε环化酶(lycopene epsilon cyclase)是叶黄素代谢途径中处于分支位点的关键酶。它催化线性的番茄红素选择性环化,形成胡萝卜素,再进一步合成叶黄素(lutein)。本研究的目标是克隆原壳小球藻(Chlorella protothecoides CS-41)LCYE基因的全长cDNA,通过该基因的生物学信息分析预测其表达产物的空间结构与功能位点,并验证该表达产物的生物学活性。【方法】采用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends)和RT-PCR技术克隆原壳小球藻LCYE基因的全长cDNA序列。分别采用PredictProtein、Pfam HMMs和Swiss-Model等在线分析软件分析LCYE的基本生物学信息,预测蛋白质功能位点和空间结构。利用pET28-a(+)构建LCYE基因的原核表达质粒pET-LCYE,并转入大肠杆菌BL21(DE3),再利用IPTG诱导LCYE基因超量表达。此外,携带pAC-LYC质粒的大肠杆菌工程菌能够积累番茄红素,可用于验证LCYE基因编码蛋白的酶活。【结果】获得了原壳小球藻的LCYE基因的cDNA序列,长2107bp,GenBank登录号为FJ752528。序列分析表明:它含有1731bp的完整开放阅读框(ORF),编码576个氨基酸,与高等植物和其他藻类的LCYE有很高的相似性,其中相似性最高的是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii XM001696477.1),达到67%。第48～459个氨基酸残基为一个典型的番茄红素环化酶蛋白(Lycopene cyclase protein)结构域(pfam05834),第261～284个氨基酸残基为一个典型的环化酶保守的模体。SDS-PAGE检测表明,LCYE基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了超量表达。携带pAC-LYC质粒的大肠杆菌工程菌在获得LCYE基因后,其颜色从粉红色变为黄色。【结论】原壳小球藻LCYE基因的全长cDNA为2107bp,预测出番茄红素ε环化酶所特有的保守功能区域,构建了它的三维结构模型。同时,阐明了小球藻和衣藻的亲缘关系。最后,证实了本研究克隆到的LCYE基因编码的蛋白具有番茄红素ε环化酶的功能与活性。