炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合蛋白的原核表达及其反应原性研究

【目的】构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202 PA-LF 1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据。【方法】根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF 1基因片段,经XhoⅠ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF 1融合基因片段,利用SWISS-MODEL分析软件分别对PA、LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(+)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性。【结果】从炭疽芽孢杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF 1和PA-LF 1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF 1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。【结论】PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分。

中国荷斯坦牛LF基因多态性与泌乳性状及乳腺炎的关联分析

乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是保护乳腺组织的防御因子之一,在机体抵抗乳腺炎方面起着重要作用。本研究采用PCR-SSCP技术和测序的方法对宁夏农垦303头中国荷斯坦牛的LF基因进行了遗传多态性分析,利用一般线性模型分析LF基因g.4388G>C位点突变对日产奶量、测定日乳脂率、测定日乳蛋白率及体细胞评分4个泌乳性状的影响。结果显示,LF基因g.4388G>C突变位点与日产奶量、乳脂率和体细胞评分值存在显著关联(P<0.05)。多重比较结果表明,GC基因型个体的体细胞评分(SCS)值极显著低于GG和CC基因型个体(P<0.01),因此,可尝试将GC基因型作为乳腺炎抗性的优良基因型应用于奶牛育种中。

大通牦牛LF基因的克隆与分子特征

通过RT-PCR克隆了牦牛包含LF基因编码区的cDNA序列(GenBank登录号为EU547251);将克隆获得的LF基因的cDNA与乳牛相应序列进行了比对;对牦牛LF蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号为ACB29794)与其他物种的相应序列进行了比较,应用在线生物软件对牦牛LF蛋白的特性和结构进行了预测。结果表明,克隆获得的牦牛LF基因cDNA片段长度为2 344 bp,其中LF基因编码区全长2 124bp,编码708个氨基酸;克隆获得的牦牛cDNA序列与乳牛该序列存在15个碱基的变异;各物种LF蛋白具有较高的同源性,LF蛋白进化树符合物种进化规律;牦牛LF蛋白含有α-螺旋36.0%、β-折叠22.4%、β-转角31.1%、无规卷曲12.9%;同源建模预测的LF 3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成的2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由一段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈"二枚银杏叶型"结构。

天祝白牦牛LF基因克隆及分子特征

【目的】哺乳动物乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等方面起着重要作用。本试验对天祝白牦牛乳铁蛋白基因的编码区进行克隆和分子特征分析。【方法】以处于干乳期的天祝白牦牛乳腺组织为材料,通过RT-PCR克隆了包含LF基因编码区的cDNA序列(GenBank收录号为EU547252);将克隆获得的天祝白牦牛LF基因的cDNA与奶牛相应序列进行比对;对天祝白牦牛LF蛋白(GenBank收录号为ACB29795)与其它物种LF蛋白进行序列比对和进化树分析;对牦牛LF蛋白的特性和结构进行预测。【结果】克隆获得天祝白牦牛LF基因cDNA片段长度为2344bp,其中LF基因编码区全长2124bp,编码708个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛cDNA序列与奶牛该序列存在15个碱基的变异,其中位于LF基因编码区的变异有12个,这些突变造成4个氨基酸变异;天祝白牦牛LF蛋白与奶牛、人、小鼠、山羊、绵羊、猪、狗、马、骆驼、猩猩、鸡LF蛋白氨基酸相似度分别为99.4%、69.5%、63.5%、92.4%、91.5%、72.9%、69.1%、72.6%、75.3%、69.5%和50.9%;各物种LF蛋白进化树符合物种进化规律;同源建模预测LF3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由1段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈"二枚银杏叶型"结构。【结论】从天祝白牦牛克隆获得LF基因编码区全长序列并揭示了其分子特征,为牦牛LF蛋白基因工程和蛋白质功能的研究奠定了基础。

荷斯坦牛LF基因5’UTR区多态性分析

本研究采用PCR-SSCP技术对303头奶牛的乳铁蛋白基因5’UTR区进行遗传多态性检测,以确定其等位基因数以及核苷酸变异位点,探讨其遗传特性结果表明,LF基因在扩增区域的64bp处发生G→C的突变,形成AA、AB、BB三种基因型,其基因型频率分别为0.2541、0.4455和0.3004,等位基因A和B的频率分别为0.4796和0.5231。群体遗传学分析发现荷斯坦牛LF基因的有效等位基因数(Ne)、遗传杂合度(He)和多态信息含量(PIC)分别是0.4989、0.4455和0.3745。经卡方适合性检验表明该群体处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。中国荷斯坦牛LF基因5’UTR区的多态性相对较高,遗传变异相对较大,提示该位点有望作为荷斯坦牛乳腺炎抗病育种的标记位点之一。

奶山羊LF基因CDS区克隆、生物信息学分析及其乳中含量测定

为了解奶山羊乳铁蛋白(lactoferrin,LF)基因的生物学特性,分析萨能奶山羊不同泌乳时期乳中LF含量的变化,试验扩增了萨能奶山羊乳腺上皮细胞LF基因CDS区序列,运用生物信息学软件对奶山羊LF基因的核苷酸序列特性、编码蛋白的理化性质、保守结构域及高级结构、与其他物种的同源性等进行了分析,并对奶山羊乳样品进行了ELISA测定。结果表明,萨能奶山羊LF基因长为2 127bp,编码708个氨基酸,编码蛋白质的分子式为C3405H5365N949O1024S43,是一个不稳定的亲水性蛋白,二级结构包含α-螺旋、延伸链和无规则卷曲,具有与转铁蛋白相似的折叠方式;羊乳铁蛋白氨基酸残基组成单链,形成77.359ku具有高级结构的糖蛋白;通过比对发现,牛科LF氨基酸序列的同源性较高(>92%),与其他物种的差异较大,其中萨能奶山羊与山羊的同源性最高(99%),且处于进化树的同一个分支。ELISA检测结果发现,奶山羊初乳中LF含量最高,常乳中的含量较低且较为稳定。研究结果初步表明了萨能奶山羊LF序列和结构域特点,揭示了萨能奶山羊乳中LF含量的变化规律,为LF功能研究、产品研发等提供参考。

奶牛乳铁蛋白基因5′侧翼区遗传多态性及其与乳腺炎关联性分析

牛乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是保护乳腺组织的防御因子之一,是具有多种功能的糖蛋白。关于牛LF基因的多态性研究的报道较多,但其多态性与奶牛乳腺炎相关性的研究较少。文章采用PCR-RFLP、CRS-PCR对268头中国荷斯坦牛LF基因启动子区的-926(G/A)、-915(T/G)、-478(/G)、+72(T/C)突变进行基因型分型,应用最小二乘线性模型分析LF基因多态性与体细胞评分(Somaticcellscore,SCS)的相关性。结果表明,新发现+72(T/C)和-478(/G)对SCS有显著影响,而其他两个位点对SCS影响不显著(P>0.05)。+72(T/C)的AB基因型是优良基因型,其个体的SCS值均显著低于AA型(P<0.01)、BB型个体(P<0.05)。-478(/G)位点的C等位基因是优良的等位基因,CC基因型个体的SCS值极显著低于CD、DD基因型个体(P<0.01)。因此,LF基因+72(T/C)的AB基因型和-478(/G)位点的CC基因型均是奶牛乳腺炎抗性的优良基因型,可作为分子标记应用于奶牛乳腺炎抗性筛选。

藏绵羊乳腺乳铁蛋白的克隆及序列分析

本研究以四川若尔盖县藏系绵羊为材料,利用RT-PCR方法扩增并克隆了藏绵羊乳铁蛋白(lactoferrin,LF)序列,运用生物信息学软件对其核苷酸序列和编码蛋白质的结构进行预测和分析。结果表明,克隆的LF基因全长2127 bp,共编码708个氨基酸,N端有19个氨基酸组成的信号肽,该蛋白质等电点为8.4,预测分子质量为77.2 ku;半定量RT-PCR分析结果表明,LF在乳腺、气管、淋巴、肝脏、泪腺和脾脏中都有表达,在肺脏中不表达。本试验克隆了藏绵羊LF cDNA全序列,并对LF和乳铁蛋白肽(lfcin,Lfc)核苷酸和蛋白质进行了分析,为进一步研究其生物学活性奠定基础。

铁对泌乳期小鼠乳腺中乳铁蛋白基因mRNA水平的影响

探讨铁对小鼠乳腺中乳铁蛋白(lactoferrin,LF)mRNA基因表达的影响。选取雌性昆明白小鼠40只,随机分成5组,按实验动物标准饲养,各处理组添加不同水平和来源的铁:硫酸亚铁(Fe0mg/kg)、硫酸亚铁(Fe60mg/kg)、硫酸亚铁(Fe120mg/kg)、甘氨酸铁(Fe120mg/kg)、甘氨酸铁+硫酸亚铁(Fe120mg/kg)。配种、产仔,于哺乳21d后处死取样,用相对定量RT-PCR方法,以β-actin作内标,测乳腺LFmRNA丰度。试验表明,不同来源和剂量的铁可不同程度影响LFmRNA的表达,甘氨酸铁(Fe120mg/kg)组较对照组差异达极显著水平(P<0.01)。因此,甘氨酸铁可显著提高乳腺中LFmRNA的表达量,作为有效铁补充剂的同时可能促进乳汁中LF的含量。

牦牛乳铁蛋白基因多态性及其与乳品质性状的关联分析

试验旨在检测牦牛乳铁蛋白(lactoferrin,LF)基因多态性,评估基因突变对牦牛乳品质性状的影响,以期丰富牦牛重要经济性状的分子遗传研究。应用PCR-SSCP方法,检测甘南牦牛、西藏牦牛和天祝白牦牛LF基因5′UTR和内含子4突变,结合甘南牦牛乳品质测定,评估基因突变对其乳品质性状的影响。结果表明,牦牛LF基因5′UTR检测到c.-568 G>A的突变,等位基因A_(1)和基因型A_(1)B_(1)频率最高,为优势等位基因和基因型;内含子4检测到c.499+56 C>A突变,基因型A2B2频率最高,为优势基因型,等位基因A2为甘南牦牛和天祝白牦牛优势等位基因,而B2为西藏牦牛优势等位基因;各类群牦牛检测区域多态信息含量(PIC)介于0.25~0.50,属中度多态。关联分析表明,甘南牦牛LF基因突变影响部分胎次甘南牦牛乳品质性状,其中5′UTR第2胎基因型A_(1)A_(1)和A_(1)B_(1)个体无脂固体物质百分含量显著高于B_(1)B_(1)个体(P<0.05);内含子4第3胎基因型A2B2和B2B2个体乳脂率显著高于A2A2型个体(P<0.05),第4胎基因型B2B2个体的乳脂率显著低于A2A2和A2B2型个体(P<0.05)。以上结果表明,甘南牦牛、西藏牦牛和天祝白牦牛LF基因存在多态性,甘南牦牛LF基因5′UTR、内含子4突变分别影响无脂固体物质含量和乳脂率,可以作为潜在的分子遗传标记。

牛副结核分枝杆菌可视化RPA-LFS快速检测方法的建立及应用

本研究针对副结核分支杆菌(MAP)F57基因特异性保守序列,设计RPA引物和nfo探针,建立了快速检测MAP的结合侧流层析试纸条的肉眼可视化RPA检测方法(RPA-LFS)。结果显示,所建立的RPA-LFS方法在金属浴中39℃恒温振荡反应20 min后,将产物加至侧流层析试纸条中,可在5 min内实现对检测结果的肉眼可视化判定;所建立的RPA-LFS方法特异性强,仅对MAP产生扩增,与其他常见可引起牛腹泻的病原均无交叉反应;以含有F57基因全长的重组质粒pTOPO-T-F57作为模板,RPA-LFS的检出限为12 copies。进一步应用RPA-LFS方法对57份牛腹泻临床样本进行MAP检测,检出9份阳性结果,与实时荧光PCR方法检测结果一致。本研究建立的副结核分支杆菌可视化RPA-LFS方法操作简单,反应快速,不依赖于复杂精准的仪器设备、专业技术人员和严格的实验室环境条件,为养殖场一线的MAP现场检测提供了一种新的解决方案。

猪圆环病毒2型可视化RPA快速检测方法的建立

本研究针对猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)的cap基因保守序列,设计特异性RPA引物和nfo探针,建立了一种快速检测PCV2的基于侧流层析试纸条的可视化RPA方法(lateral flow strip RPA,LFS-RPA)。结果,建立的LFS-RPA方法最佳反应条件是39℃恒温扩增20 min,可在5 min内实现对检测结果的肉眼可视化判定;该方法特异性强,仅对PCV2出现阳性扩增,对本研究涉及的其他猪重要病原均无交叉反应;以含PCV2全长序列的重组质粒为模板,LFS-RPA的检出限为10 copies/μL。进一步应用建立的LFS RPA方法对30份猪临床样品进行PCV2检测,并与real-time PCR方法进行比较,结果显示两种方法的检测一致性达86.7%(26/30),其中4份C;值在36~38之间的临床样品利用LFS-RPA方法检测为阴性。上述结果表明,本研究建立的LFS-RPA方法操作简单,对仪器设备要求低,可以快速且直观的实现对检测结果的判断,可以满足现场检测的要求,对养猪场一线PCV2快速诊断和防控具有重要现实意义。