小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的:用原核表达的方法获得带有6个His标记的小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术,从小鼠心肌组织中扩增出小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件cDNA片段,将该片段与原核表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pETLG1-3并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组表达菌株。用IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETLG1-3表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子质量60000处有特异性重组蛋白表达条带,并经Western印迹进一步鉴定。用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度。结果:从小鼠心肌组织中克隆了层粘连蛋白α5链LG3组件的基因,并在大肠杆菌得以表达和纯化;制备了重组蛋白的多克隆抗体,其滴度可达到1∶10240。结论:小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能打下了基础。

人层黏连蛋白α4链LG1-3组件的克隆及酵母表达

目的:利用巴斯德毕赤酵母表达系统获得重组的人层黏连蛋白LG1-3组件蛋白,为进一步研究LG1-3的结构和功能间的关系奠定基础。方法:利用RT-PCR从人胎盘组织总RNA中扩增LG1-3组件cDNA,并重组入pPICZαA,电转化入毕赤酵母GS115,利用甲醇诱导表达目的蛋白。结果和结论:获得了1 800 bp LG1-3组件cDNA,利用体外定点突变将SacⅠ酶切位点GAGCTC突变为GAGCGC,经SDS-PAGE和W estern印迹检测到相对分子质量为67.48×103的LG1-3组件蛋白的表达。