龙州凤仙花ImLHY和ImC4H基因克隆及表达分析

【目的】对龙州凤仙花晚期下胚轴蛋白基因(ImLHY)和肉桂酸-4-羟基化酶基因(ImC4H)进行克隆及表达分析,探讨龙州凤仙花旗瓣和翼瓣的彩斑区和非斑区颜色差异,克隆LHY和C4H基因,为凤仙花彩斑分子调控机制及花色改良和新品种培育提供理论依据。【方法】以龙州凤仙花为材料,测定其旗瓣和翼瓣的彩斑区和非斑区色度值以及总花色苷和总黄酮含量,对ImLHY和ImC4H基因进行克隆,利用生物信息学软件对其进行序列特征、蛋白结构和系统发育分析,利用实时荧光定量PCR检测ImLHY和ImC4H基因在不同关键发育时期(花苞期、盛花期和衰败期)旗瓣和翼瓣不同着色区的表达模式。【结果】旗瓣和翼瓣的彩斑区a*(红度值)和C*(彩度值)均高于非斑区,非斑区的L*(亮度值)大于彩斑区;旗瓣彩斑区b*(黄度值)高于旗瓣非斑区,而翼瓣彩斑区与非斑区的b*(黄度值)差异较小,且旗瓣和翼瓣的彩斑区总花色苷和总黄酮含量均高于非斑区。克隆获得ImLHY和ImC4H基因的cDNA全长分别为1698和1518 bp,分别编码565和505个氨基酸残基,GenBank登录号分别为OR096417和OR096418。ImLHY和ImC4H蛋白均为亲水性不稳定蛋白,均不具有跨膜结构域。ImLHY蛋白有1个Myb DNA-binding保守结构域,且具有MYB转录因子家族的SANT结构域,定位于细胞核中;ImC4H蛋白含有1个P450超家族结构域(PLN02394),定位于内质网上。ImLHY和ImC4H蛋白分别与喜马拉雅凤仙花LHY和C4H的氨基酸序列相似性达68%和94%,且在系统发育进化树中二者分别均与喜马拉雅凤仙花LHY和C4H蛋白聚在一支。ImLHY和ImC4H基因在3个关键发育时期(花苞期、盛花期和衰败期)旗瓣和翼瓣的彩斑区和非斑区中均有表达,且整体表现为在盛花期的相对表达量较高;在盛花期时,ImLHY和ImC4H基因在旗瓣的相对表达量均表现为彩斑区显著高于非斑区(P<0.05),在翼瓣的相对表达量均表现为非斑区高于彩斑区。【结论】ImLHY和ImC4H基因在盛花期时主要调控旗瓣彩斑形成,而在翼瓣主要调控非斑区形成,推测旗瓣和翼瓣的彩斑形成存在不同的调控机制。

鹰嘴豆LHY基因cDNA克隆及生物信息学分析

从鹰嘴豆中克隆生物节律钟LHY基因的cDNA全长序列,进行序列信息学分析。通过同源克隆策略,利用RT-PCR技术获得核心片段,结合5'-RACE和3'-RACE技术,克隆得到鹰嘴豆生物节律钟基因LHY的cDNA全长序列,其核苷酸序列长度为3 061 bp,包括2 220 bp的完整开放阅读框(ORF),编码739个氨基酸。验证后命名为CarLHY基因,获得基因登录号为KJ558378。生物信息学研究表明CarLHY基因cDNA序列与其他植物LHY基因具有较高的相似性;预测CarLHY蛋白不具有跨膜结构;为转录因子,定位于细胞核中;不具备信号肽。对CarLHY蛋白功能结构域预测表明,蛋白质核心结构存在符合转录因子与DNA结合的常见功能域HTH。蛋白系统进化树显示,与大豆分子进化距离最近,其次是黑杨、拟南芥。

拟南芥LHY基因超表达与成花转变

高等植物的成花转变受到多个基因网络的调控,植物从营养生长转变为生殖生长,与植物自身发育的生物节律相关,然而生物钟(circadian clock)相关基因在其中的调控作用仍不清楚。本研究通过构建超表达载体pCAMBIA-3301-35S::LHY,遗传转化后获得超表达植株,分析超表达生物节律基因LHY对成花转变的影响。结果表明,LHY超表达植株具有18片莲座叶,野生型植株为12片;LHY超表达植株在第33天出现可见花芽,野生型植株则为20 d,超表达植株表现出晚花表型。茎端分生组织解剖结构分析表明,LHY超表达植株在第19天(野生型植株15 d)时生长锥持续生长发育,凸起明显增高,具多层原套细胞,原体和髓分生组织细胞分裂,数量增多,说明超表达植株营养生长成熟期延迟,导致晚花。qRT-PCR对miR156及其靶基因SPL3表达水平检测结果表明,LHY超表达植株的miR156表达量随植物发育进程逐渐降低,而SPL3表达量则逐渐升高,LHY超表达植株可能通过调控miR156和SPL3的表达量来调控成花转变。