胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中表达的实验研究

目的:研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中的表达。方法:利用组织块法体外培养人牙髓细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂。培养14d后,免疫细胞化学检测牙本质涎蛋白的表达;von kossa染色检测矿化结节的形成。培养期间,采用半定量RT-PCR技术监测LIM矿化蛋白1及碱性磷酸酶的表达,SPSS11.0软件分析结果。结果:培养14d,实验组牙本质涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达,von kossa染色阳性,矿化结节形成;对照组牙本质涎蛋白表达阴性,von kossa染色阴性。RT-PCR结果显示碱性磷酸酶及LIM矿化蛋白1在实验组和对照组各时段均表达。培养期间,实验组LIM矿化蛋白1的表达显著性高于对照组,其中培养第2天及9天时表达分别达到两个高峰,约为对照组的1.8倍及3.0倍。培养期间,碱性磷酸酶的表达显著性增高,其中培养14d时约为对照组的2.0倍。结论:首次发现LIM矿化蛋白1与人牙髓细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白1可能在牙髓细胞的分化及矿化中发挥一定作用。

胞内信号转导分子LIM矿化蛋白-1在人牙周膜细胞体外矿化过程中表达的实验研究

目的:研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白-1在人牙周膜细胞体外矿化过程中的表达。方法:利用组织块法体外培养人牙周膜细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂。培养14 d后,免疫细胞化学检测骨涎蛋白的表达;von Kossa染色检测矿化结节的形成。培养期间,采用半定量RT-PCR技术监测LIM矿化蛋白-1、碱性磷酸酶的表达,SPSS11.0软件分析结果。结果:培养14 d,实验组骨涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达,von Kossa染色阳性,矿化结节形成;对照组骨涎蛋白表达阴性,von Kossa染色阴性。RT-PCR结果显示碱性磷酸酶、LIM矿化蛋白-1在实验组和对照组各时段均表达。培养期间,实验组LIM矿化蛋白-1的表达显著高于对照组,其中培养第3 d、14 d时表达分别达到两个高峰,约为对照组的1.4倍、1.5倍。培养期间,碱性磷酸酶的表达显著增高,其中培养14 d时约为对照组的1.5倍。结论:首次发现LIM矿化蛋白-1与人牙周膜细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白-1可能在牙周膜细胞的分化、矿化中发挥一定作用。

LIM矿化蛋白1在大鼠牙髓损伤修复中的时空表达

目的 :探讨LIM矿化蛋白1(LIM mineralization protein 1,LMP-1)在大鼠磨牙牙髓损伤修复中的表达。方法 :建立大鼠磨牙牙髓损伤修复动物模型,用免疫组织化学染色方法观察LMP-1在大鼠牙髓损伤修复中的表达,并用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件及单因素方差分析比较各组间的差异。结果 :在正常大鼠牙髓组织中LMP-1表达阴性;在大鼠牙髓损伤后1 d,LMP-1表达于成牙本质细胞及部分牙髓成纤维细胞;术后3 d,LMP-1表达于坏死牙髓下方的细胞增殖层;术后7 d,LMP-1显著表达于增殖活跃的牙髓细胞及部分成牙本质细胞中。结论:LMP-1在牙髓损伤修复过程中呈时空特异性表达,可能参与成牙本质细胞及牙髓细胞的增殖、分化及修复性牙本质的形成。

雌激素对小鼠骨髓间质细胞LIM矿化蛋白-1 mRNA表达的影响

目的探讨雌激素对小鼠骨髓间质细胞LIM矿化蛋白-1(LIMmineralization protein-1,LMP-1)基因转录的影响。方法卵巢切除5个月后小鼠的骨髓间质干细胞经7 d成骨诱导后,用100 nmol/L 17β-雌二醇(17β-E2)处理24 h,通过RT-PCR法扩增LMP-1的mRNA,测定扩增条带的吸光度值,并用其与β-actin吸光度的比值来表示产物mRNA的相对含量。结果17β-E2处理组LMP-1的mRNA表达明显高于非处理组(P<0.01)。结论雌激素可通过促进骨髓间质细胞LMP-1的mRNA表达以发挥其促成骨作用。

LIM矿化蛋白1过表达对骨肉瘤细胞系OS-9901细胞增殖的影响

目的探讨骨肉瘤细胞系OS-9901细胞中LIM矿化蛋白1(LMP-1)过表达对该细胞增殖的影响。方法构建LMP-1过表达慢病毒载体,通过脂质体转染进骨肉瘤细胞系OS-9901细胞。通过荧光定量PCR和Western blot检测LMP-1过表达情况,并通过BrdU掺入实验比较LMP-1过表达前后细胞增殖情况。结果转染了LMP-1过表达慢病毒载体6 h后细胞内LMP-1 mRNA和蛋白表达均无显著变化(P>0.05),且DNA合成量无显著变化。而当LMP-1过表达慢病毒载体转染细胞12、24和48 h后细胞内LMP-1 mRNA和蛋白表达量均显著提高的同时,DNA合成量显著降低(P<0.05)。结论 LMP-1过表达可抑制骨肉瘤细胞系OS-9901细胞增殖。

雌激素活化LIM矿化蛋白-1的mRNA表达与雌激素受体的关系

目的探讨雌激素受体信号转导与LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因转录的关系。方法将卵巢切除5个月后小鼠的骨髓间充质干细胞经7d成骨诱导后,用10μmol/L的ICI-182,780(ICI)和/或100nmol/L17β-雌二醇(17β-E2)处理24h,通过RT-PCR法扩增LMP-1的mRNA,测定扩增条带的吸光度值,并与β-actin的吸光度值相比,比值来表示产物mRNA的相对含量。结果ICI处理组LMP-1的mRNA表达明显低于17β-E2处理组(P<0.01)。结论雌激素刺激间充质干细胞LMP-1的mRNA表达是雌激素受体依赖性的。

LIM矿化蛋白1对牙周膜细胞生物学特性的影响

目的以LIM矿化蛋白1(LIM mineralization protein 1,LMP-1)基因构建真核表达载体PET43.1a-LMP-1,转染人牙周膜细胞,观察对其生物学特性的影响。方法采用基因工程技术构建真核表达载体pET43.1a-LMP-1,脂质体法转染人牙周膜细胞,四唑盐比色法和酶联免疫吸附测定法测定真核表达载体pET43.1a-LMP-1转染对牙周膜细胞活性以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的影响。结果与空质粒转染组和空白对照组相比,pET43.1a-LMP-1真核表达载体转染后牙周膜细胞中LMP-1 mRNA和蛋白表达显著增强(P<0.05);细胞增殖明显增加;ALP表达明显增强,并随时间延长逐渐上升。结论外源性LMP-1转染进入牙周膜细胞能够促进细胞的增殖和矿化能力。

LIM矿化蛋白1在牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞中的研究进展

LIM矿化蛋白1(LMP-1)是一种胞内信号转导分子,体内外研究表明它在成骨细胞分化过程中起到促进骨形成的重要作用。目前认为LMP-1是通过刺激某些诱导骨形成的因子如骨形态发生蛋白(BMP)的合成及分泌发挥作用,从而提高骨形态发生蛋白及其他成骨因子的成骨活性。该文围绕LMP-1的作用及在牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞矿化方面的研究现状作一综述。

高浓度地塞米松通过下调LMP-1表达抑制大鼠成骨细胞的分化

为探讨地塞米松 (dexamethasone ,DEX)抑制成骨细胞分化的机制 ,观察了不同浓度DEX对体外培养大鼠成骨细胞的碱性磷酸酶活性、骨钙素 (osteocalcin ,OC)合成、Ⅰ型胶原蛋白表达的影响 ,并用RT PCR方法检测了成骨细胞中LIM矿化蛋白 1mRNA的表达量。结果显示 :低浓度 ( 10 -9mol/L)的DEX能增强碱性磷酸酶的活性、OC的分泌和Ⅰ型胶原蛋白的表达 ;而高浓度 ( 10 -7mol/L)的DEX对它们则起抑制作用 ,并下调成骨细胞正调节因子LMP 1mRNA的表达。上述结果表明 ,低浓度的DEX促进成骨细胞的分化 ;高浓度的DEX则抑制成骨细胞的分化 ,其抑制作用可能是通过下调LMP

重组腺病毒载体Ad-LMP-1的构建及其转染MSC后成骨活性

【目的】快速构建大鼠LIM矿化蛋白-1基因重组腺病毒载体,转染MSC,探讨LMP-1基因对MSC成骨分化和成骨活性的影响。【方法】从大鼠成骨细胞内提取总RNA,并设计LMP-1特异性引物进行RT-PCR,获取LMP-1基因后利用Invitrogen公司的TOPO定向克隆技术创建入门克隆pENTR/D-LMP-1。转化TOP10细菌后,挑取阳性克隆摇菌提取质粒,入门克隆再与表达载体pAD/CMV/V5-DEST进行同源重组反应得到病毒载体pAD/CMV/V5-LMP-1,转化细菌后挑选阳性克隆摇菌提取重组病毒质粒,用PacI内切酶线性化后用转染293A细胞后得到重组腺病毒载体。以腺病毒为载体,将大鼠LMP-1基因体外转染于3代大鼠MSC细胞内,检测LMP-1基因在MSC细胞的表达,分别观察转染后实验组与对照组I型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素表达变化以及骨钙结节的形成情况,评价LMP-1基因的成骨能力。【结果】成功获取大鼠LMP-1基因,入门质粒与病毒表达质粒经过酶切鉴定以及测序验证。LMP-1基因能在MSC中高效表达,转然后MSC的I型胶原,碱性磷酸酶、骨钙素的表达明显增强,骨钙结节形成增多。【结论】利用Gateway技术构建LMP-1重组腺病毒载体相对简单,可快捷获得的pAd-LMP-1。pAd-LMP-1转染MSC后,LMP-1基因能促进MSC向成骨细胞分化,增强其成骨作用。

人LMP-1基因腺病毒重组体的构建及其在骨肉瘤细胞U2OS中的表达

目的:构建表达人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)细胞系U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达。方法:以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对LMP-1进行扩增,通过TA克隆与pGEM-T载体连接并DNA测序。双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和DNA测序鉴定,并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达。线性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒Ad-LMP-1。通过脂质体介导,在HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1,大量扩增、纯化并测定滴度。用Ad-LMP-1感染OS细胞系U2OS,通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测LMP-1在U2OS细胞中的表达。结果:双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功,荧光显微镜证实转染了pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组。通过扩增、纯化,Ad-LMP-1滴度达到1.5×109pfu/ml。荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的U2OS内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot检测发现重组腺病毒感染U2OS后,LMP-1的mRNA和蛋白表达量明显高于对照组。结论:成功构建了人LMP-1基因腺病毒重组体,为进一步的实验研究奠定了基础。

LIM矿化蛋白-1与颈椎后纵韧带骨化相关性的实验研究

[目的]研究LIM矿化蛋白-1（LMP-1）与颈椎后纵韧带骨化（OPLL）形成的相关性,为OPLL的预防提供新的理论方法。[方法]选取2012年3月~2013年12月本院颈椎后纵韧带骨化患者手术切除的16例后纵韧带标本为OPLL组,非骨化的20例颈椎后纵韧带标本为非OPLL组,通过免疫组织化学染色及RT-PCR技术分别检测两组标本中LMP-1及其mRNA的表达情况。[结果]LMP-1在OPLL组及非OPLL组中均有表达;LMP-1在OPLL组中表达量高于非OPLL组,二者差异有统计学意义（P〈0.05）。[结论]LMP-1与OPLL的形成有一定的相关性,是OPLL形成的原因之一;通过调节LMP-1的表达可能对OPLL的防治提供一个新的理论基础。

人LIM矿化蛋白-1重组腺病毒的成骨作用及其分子机制

目的 利用pAdEasy腺病毒载体系统构建人LIM矿化蛋白-1（LMP-1）重组腺病毒,检测其在体外培养大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的促成骨作用并分析其分子机制.方法 应用聚合酶链反应（PCR）法扩增出人LMP-1全长基因,插入pShuttle-IRES-hrGFP-1中构建成腺病毒穿梭质粒pS-LMP-1-GFP,转化DH5a大肠杆菌,挑选细菌单克隆进行酶切鉴定和DNA测序;通过pS-LMP-1-GFP与质粒pAdEasy-1在BJ5183细胞中同源重组,得到携带人LMP-1基因的重组腺病毒载体（pAdLMP-1-GFP）.经PacⅠ酶切暴露两侧长末端重复序列,脂质体介导线性化质粒转染AD293细胞进行包装得到重组腺病毒Ad-LMP-1-GFP.以腺病毒为载体,将 人LMP-1 基因体外转染于第3代大鼠BMSCs内,检测LMP-1基因在BMSCs的表达,分别观察转染后实验组与对照组碱性磷酸酶活性变化,Western blot检测骨钙素（OCN）和β-连环蛋白（β-catenin）的表达,评价LMP-1 基因的成骨能力及其分子机制.结果 成功获取人LMP-1基因,并包装成重组腺病毒.LMP-1基因能在BMSCs 中高效表达,转染后BMSCs的碱性磷酸酶活性增强,与对照组比较P=0.000,分别为0.096、0.116、0.118、0.119（0.110±0.011）和 0.045、0.057、0.056、0.054（0.053±0.005）;骨钙素的表达显著升高,与对照组比较P=0.001,分别为0.661、0.767、0.651（0.693±0.064）和0.177、0.290、0.222（0.229±0.050）;β-catenin的表达明显增强,与对照组比较P=0.002,分别为0.841、0.806、0.867（0.838±0.030）和0.185、0.236、0.266（0.229±0.040）.结论 成功利用pAdEasy系统构建人LMP-1重组腺病毒载体,包装获得重组腺病毒.Ad-LMP-1-GFP转染BMSCs后,LMP-1基因能促进BMSCs向成骨细胞分化,并且可能通过β-catenin信号分子发挥作用.

人低氧诱导因子-1α和LIM矿化蛋白-1联合表达重组腺病毒构建及其成骨作用

目的利用内部核糖体进入位点（IRES）连接低氧诱导因子-1α（HIF-1α）与LIM矿化蛋白-1（LMP-1），构建同时表达LMP-1和HIF-1α的腺病毒载体，检测其在体外培养大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的成骨作用。方法应用聚合酶链反应（PCR）法扩增出人HIF-1α（2 481 bp）和LMP-1（1 374 bp）及IRES（564 bp）序列，依次插入pShuttle-IRES-hrGFP-1中构建腺病毒穿梭质粒pS-HIF-LMP-1-GFP；将其与质粒pAdEasy-1在BJ5183细胞中同源重组，得到重组腺病毒质粒（pAd-HIF-LMP-1-GFP）。经Pac I酶切转染AD293细胞进行包装得到重组腺病毒Ad-HIF-LMP-1-GFP。以腺病毒为载体，将人HIF-1α和LMP-1联合基因转染大鼠BMSCs细胞，分别观察转染后实验组与对照组碱性磷酸酶活性、钙形成以及骨钙素和核心结合蛋白因子2（Runx2）的表达变化，探讨HIF-1α与LMP-1联合表达的成骨作用。结果成功获取联合表达HIF-1α与LMP-1的重组腺病毒。HIF-1α和LMP-1基因能在BMSCs中高效表达，转染后BMSCs的碱性磷酸酶活性增强，与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.000），活性分别为0.145、0.160、0.170、0.167（0.160±0.011） ng/μg蛋白和0.045、0.057、0.056、0.054（0.053±0.005） ng/μg蛋白；钙沉积明显增多，与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.001），钙形成定量分别为0.636、0.544、0.591、0.515（0.570±0.050）和0.121、0.150、0.144、0.167（0.145±0.019）；骨钙素表达显著提高，与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.017），分别为2.688、2.997、2.777（2.820±0.159）和2.009、1.916、1.944（1.956±0.047）；Runx2的表达明显增强，与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.000），分别为0.440、0.465、0.456（0.454±0.010）和0.096、0.108、0.117（0.107±0.010）。结论成功利用IRES序列连接人HIF-1α和LMP-1基因构建重组腺病毒载体，Ad-HIF-LMP-1-GFP转染BMSCs后，能明显促进BMSCs向成骨细胞分化。

LIM矿化蛋白1在成骨分化前后人牙囊细胞中的表达

目的:研究人牙囊细胞成骨分化前后LIM矿化蛋白-1的表达。探讨LIM矿化蛋白-1在牙囊细胞向牙周组织分化过程中的作用。方法:组织块加酶消化法分离培养人牙囊细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂。培养4周后,免疫细胞化学检测骨涎蛋白的表达;Von Kossa染色检测矿化结节的形成。矿化诱导前后,采用RT-PCR技术检测LIM矿化蛋白-1。结果:培养4周,实验组矿化结节形成,骨涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达,Von Kossa染色阳性;对照组未形成矿化结节,骨涎蛋白表达弱阳性,Von Kossa染色阴性。RT-PCR结果显示LIM矿化蛋白-1在实验组强阳性表达,对照组弱表达。结论:LIM矿化蛋白-1与胚胎期人牙囊细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白-1可能在胚胎期牙囊细胞的分化、矿化中发挥一定作用。