Limk1不同突变体HA融合表达载体构建及在细胞内定位

目的:构建LIM激酶(Limk)1不同突变体的HA融合表达载体,并在真核细胞中表达,观察这些突变体在细胞内定位。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增Limk1全长序列,构建HA-Limk1真核表达质粒;利用定点突变策略对HA-Limk1进行核定位信号(NLS)缺失突变,命名为Limk1-NLS(del);用合成两条互补序列退火获得目标片段插入载体的策略构建Limk1-NLS;将2表达质粒转染HepG2细胞,细胞免疫荧光方法以及核质分离后用western-blot检测其在细胞中定位。结果:经测序鉴定Limk1及其不同突变体序列正确,在HepG2细胞中高表达;其中HA-Limk1在细胞质、细胞核均有表达,Limk1-NLS(del)主要定位于细胞质,Limk1-NLS主要定位于细胞核。结论:成功构建了Limk1全长及不同突变体的HA融合表达载体,初步明确突变体在细胞内的定位。

LIMK1mRNA及其蛋白在脆性X综合征小鼠大脑皮层中的表达

目的观察LIMK1mRNA及其蛋白在脆性x综合征（FXS）zb鼠大脑皮层中的表达，探讨其在FXS发病机制中的作用。方法选择雄性FMR1基因敲除型FvB近交系新生鼠和2、4、6周小鼠做为实验组（记为KO^0d、KO^2w、KO^4w和KO^6w，雄性同龄野生小鼠（WT）作为对照组（记为WT^06、WT^2w、WT^4w和WT^6W．每组每时间点9只。取小鼠单侧大脑皮层行LIMK1 mRNA实时荧光定量PCR分析，取另一侧大脑皮层行LIMK1蛋白Westem blotting分析。结果（1）KO^6w组小鼠LIMK1 mRNA含量较同龄组WT小鼠及KO^0d、KO^2w和KO^4w组小鼠明显升高．WT^0d组小鼠LIMK1 mRNA含量明显高于WT^2w、WT^4w和WT^6w组小鼠，差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）同龄KO、WT小鼠大脑皮层中LIMK1蛋白含量差异无统计学意义（P〉0．05）；KO^0d组小鼠LIMK1蛋白含量明显低于KO^0d、KO^4w和KO^6w组，WT^0d组小鼠大脑皮层中LIMK1蛋白含量明显低于KO^2w、KO^4w和KO^6w，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论LIMK1蛋白的翻译过程在6周时受到明显抑制．反馈性调节转录过程使LIMK1 mRNA表达急剧升高。KO鼠LIMK1蛋白表达下降，从而影响树突棘的骨架蛋白重构，影响树突棘的功能改变，可能是FXS神经系统改变的重要机制之一。