优化毕赤酵母X33重组表达球形马拉色菌脂肪酶LIP1

研究人工合成球形马拉色菌脂肪酶LIP1的基因,并成功在毕赤酵母X33中重组表达。利用响应面分析法,构建LIP1的酶活回归方程。由响应面分析,在温度27.0℃,pH值为7.69,酵母提取物浓度1.50%和葡萄糖浓度3.37%时,预测最大酶活为33U/mL。通过实验验证,最后结果为38U/mL。该值与模型预测基本一致。优化后的酶活提高了26.67%。通过响应面的条件优化,可以获得毕赤酵母X33重组表达LIP1的最大酶活。

解脂耶氏酵母脂肪酶基因lip1的克隆、密码子优化及功能表达

【目的】克隆解脂耶氏酵母(Yarrawia lipolytica)脂肪酶基因lip1,并通过密码子优化,首次实现其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的诱导型和组成型表达。【方法】通过PCR扩增Y.lipolytica脂肪酶基因lip1,根据P.pastoris密码子偏爱性,运用重叠延伸PCR合成改造后基因MLip1,将其分别克隆至诱导型分泌载体pPIC9K和新构建的组成型分泌载体pG AP9K上,电转至P.pastoris GS115中,G418抗性筛选得到高拷贝转化重组子,摇瓶发酵,以对硝基苯酚酯为底物检测脂肪酶水解活力,并对表达产物进行酶学性质分析。【结果】从Y.lipolytica中成功克隆了脂肪酶基因lip1(GenBank:Z50020),全长1461bp,编码486个氨基酸残基,无内含子,无信号肽;密码子优化后基因表达水平相对于出发基因有较大提高,且组成型表达优于诱导型;Lip1酶学性质分析表明,其最适底物为pNPB(C4),45℃下Tris-Hcl缓冲液pH8.5时最大水解酶活为8.07U/mL。【结论】Y.lipolytica脂肪酶基因lip1的克隆丰富了脂肪酶基因资源,其高效基因工程菌的构建为将来实现规模化生产奠定了技术基础。

人工合成CRL(褶皱假丝酵母脂肪酶)基因

通过序列设计、合成策略设计等方法 ,由CRL中最重要的同工酶LIP1的成熟多肽序列 ,生成适合在毕赤酵母中表达的基因序列sculipⅠ。通过链延伸反应及PCR反应将DNA单链人工合成为一段长为 16 35bp的DNA双链 ;并将其克隆入质粒pBluescriptⅡSK ( +)。PCR鉴定及测序结果表明sculipⅠ得到了正确的合成与克隆。还就若干长片段基因人工合成应该注意的问题进行讨论。

基于组合优化策略在毕赤酵母中高效表达杜邦嗜热菌脂肪酶

杜邦嗜热菌脂肪酶(LIP1)是一种在洗涤行业、生物柴油制备、油脂改性等领域具有良好应用潜力的碱性脂肪酶,然而其天然产量极低,难以满足产业化需求。采用组合优化策略筛选出高效表达LIP1的毕赤酵母重组菌株。首先,构建毕赤酵母密码子偏好性优化的LIP1基因,通过高浓度G418抗性平板和BMMY-罗丹明B定性平板筛选出脂肪酶活性较高的重组菌株;其次,利用信号肽优化和分子伴侣共表达优化筛选得到一株高效表达的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1,采用碱滴定法测定其酶活,采用比色法测定其底物特异性。结果表明,经组合优化策略筛选出的菌株在摇瓶和5 L发酵罐中发酵最高分泌酶活分别达到1 136 U/mL和12 150 U/mL。底物特异性结果显示重组脂肪酶LIP1最适底物为C8链长的对硝基苯酚酯。综上所述,基于组合优化策略实现了LIP1在毕赤酵母中的高效表达,为未来LIP1的产业化奠定基础。