鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N端XhoⅠ酶切位点的丢失

背景与目的;众所周知,EB病毒LMP1基因在鼻咽癌变过程起着一定的作用。本研究通过检测广东地区鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N-末端区Xho Ⅰ酶切位点的丢失,探讨LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用。方法:收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本63例。收集EB病毒健康携带者外周血单个核细胞(PBMCs)10例作为对照。采用QIAamp DNA Mini Kit和QIAampDNA Blood Mini Kit分别抽取组织和外周血单个核细胞的DNA,应用巢式PCR扩增EB病毒LMP1基因的N-末端区,并用Xho Ⅰ对扩增产物进行酶切。采用四色荧光 末端终止法对扩增产物进行序列分析。结果:10例健康携带者外周血单个核细胞的EB病毒LMP1基因N-末端区均未见Xho Ⅰ酶切位点的丢失。63例鼻咽癌组织中有50例(79.37％)出现Xho Ⅰ酶切位点的丢失(Xho Ⅰ-loss),还有4例(6.34％)为Xho Ⅰ酶切位点部分丢失,只有9例(14.29％)未见Xho Ⅰ酶切位点的丢失(wt-Xho Ⅰ)。除了Xho Ⅰ酶切位点的丢失(nt:169423～169428;GAGCTC→GA T CTC)外,还发现四个错义点突变。结论:本研究所检测的广东地区EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的EB病毒LMP1基因为wt-Xho Ⅰ,而在鼻咽癌组织中主要为Xho-Ⅰ-loss。因此,我们认为EB病毒LMP1基因N-末端区Xho Ⅰ酶切位点的丢失和其?

脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞EBV-LMP1的表达

目的探讨10～23脱氧核酶(10～23DRz)对鼻咽癌生长的抑制作用。方法设计合成针对EBV-LMP1的10～23DRz,并对其进行硫代磷酸化修饰,同时针对该位点设计突变型DRz和反义寡核苷酸,经脂质体转染C666-1细胞中观察其对LMP1基因因表达的抑制效应;建立裸鼠皮下鼻咽癌移植瘤,瘤体内注射脱氧核酶及其类似物,观察其对LMP1基因因及肿瘤生长的抑制效应。结果有效转染后,脱氧核酶在细胞内抑制LMP1基因因表达;成功建立裸鼠移植瘤模型后,脱氧核酶能高效抑制LMP1基因因表达,并能抑制肿瘤生长,其作用较突变型脱氧核酶和反义寡核苷酸强(P<0.05)。结论脱氧核酶在鼻咽癌细胞中及移植瘤模型中都能高效抑制LMP1的表达,可能成为一种高度特异性的、高效的基因治疗剂。

Epstein-Barr病毒LMP1-exonl反义表达载体对NPC细胞生长的抑制作用

目的 研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法 用反义LMP1DNA的真核表达载体anti pcDNA3.1 LMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2 ,G4 18筛选抗性克隆 ;Western blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达 ;用MTT法、细胞生长曲线和软琼脂集落形成能力实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果 建立反义CNE2细胞克隆 ;转染后LMP1蛋白表达降低 ;转染后细胞活力和生长速度均有下降 ,集落形成能力显著降低。结论 将反义LMP1真核表达载体导入细胞能成功抑制NPC细胞的生长 ,逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。

靶向EBV-LMP1脱氧核酶对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的:观察EBV-LMP1基因的靶向脱氧核酶(DZ)对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响.方法:设计并合成针对EBV-LMP1基因的脱氧核酶DZ509,突变型脱氧核酶mut-DZ509及其反义寡核苷酸ASODN509.裸鼠皮下注射鼻咽癌细胞(C666-1),建立皮下移植瘤模型,肿瘤形成后分为瘤内注射DZ50960μmol/L,mutDZ50960μmol/L,ASODN509106μmol/L,PBS50μL;记录肿瘤生长曲线,采用半定量RT-PCR法检测LMP1mRNA表达,免疫组化方法,WesternBlot检测LMP1蛋白表达.结果:成功构建裸鼠皮下鼻咽癌移植瘤模型.DZ509组,mutDZ509组,ASODN509组与对照(PBS)组相比较,肿瘤生长速度依次减慢,3组抑瘤率分别为85.53%,73.03%,52.77%.LMP1mRNA及蛋白表达依次增加,差异具有统计学意义(P<0.05).结论:瘤体内注射DZ能有效抑制LMP1表达并抑制鼻咽癌移植瘤生长,针对EBV-LMP1的DZ可能成为鼻咽癌治疗的基因药物.

广州地区鼻咽癌EB病毒LMP1基因N端XhoI酶切位点的丢失

目的 检测广州地区鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N -末端区XhoI酶切位点的丢失 ,探讨LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用。方法 收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌新鲜活检标本 63例以及EB病毒健康携带者外周血单个核细胞 10例。采用QIAampDNAMiniKit和QIAampDNABloodMiniKit分别抽取组织和外周血单个核细胞的DNA ,应用巢式PCR扩增EB病毒LMP1基因的N -末端区 ,并用XhoI对扩增产物进行酶切。采用四色荧光末端终止法对扩增产物进行序列分析。结果 10例健康携带者外周血单个核细胞的EB病毒LMP1基因N -末端区均未见XhoI酶切位点的丢失。 63例鼻咽癌组织中有 5 0例 ( 79%)出现XhoI酶切位点的丢失 (XhoI -loss) ,4例 ( 6%)为XhoI酶切位点部分丢失 ,只有 9例 ( 14 %)未见XhoI酶切位点的丢失 (wt -XhoI)。除了XhoI酶切位点的丢失 (nt:16942 3～16942 8;GAGCTC→GATCTC)外 ,还发现 4个错义点突变。结论 广州地区EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的EB病毒LMP1基因为wt -XhoI ,而在鼻咽癌组织中主要为XhoI -loss。因此 ,我们认为EB病毒LMP1基因N -末端区XhoI酶切位点的丢失和其他的错义点突变可能是在鼻咽癌的发生发展过程中产生的。

重组抗LMP1单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建及表达

目的体外拼装人抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1单链抗体(LMP1 scFv)/截断的鱼精蛋白截短体(truncatedprotamine,tP)融合基因,将其克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌中诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白。方法设计融合基因LMP1 scFv/tP,在LMP1 scFv/tP的5’和3’端设计EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点;在DNAWORKS程序指导下设计成22个相互互补的寡核苷酸序列,经PCR扩增获得融合基因LMP1 scFv/tP,再将目的基因片段亚克隆至pMD 18-Tsi mple载体中,经过酶切鉴定和测序验证。进一步将目的基因片段克隆至原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白并经SDS-PAGE和western blot验证。结果各寡核苷酸片段经PCR扩增后可见明确的产物带,将获得的LMP1 scFv/tP融合基因构建至原核表达载体pET32a,经IPTG诱导后成功表达目的蛋白。结论成功获得LMP1 scFv/tp融合基因,并在大肠杆菌中成功诱导表达LMP1 scFv/tP融合蛋白,为该融合蛋白用于LMP1相关肿瘤的基因治疗奠定基础。

LMP1诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗的体外实验

目的探讨EBV膜潜伏蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)基因过表达后对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)凋亡诱导作用和凋亡信号传导的影响。方法利用脂质体介导的pGL6-LMP1上调LMP1低表达的TRAIL抵抗性鼻咽癌细胞CNE-1中LMP1的表达;通过MTT比色法、流式细胞术观察LMP1过表达后对CNE-1细胞TRAIL敏感性的影响;流式细胞术、Western blot、线粒体膜电位检测观察LMP1过表达后对死亡受体表达、细胞内外凋亡信号通路激活、线粒体膜电位改变的影响。结果死亡受体荧光标记后流式细胞术检测发现CNE-1和CNE-1-LMP1之间细胞膜蛋白死亡受体4(death receptor 4,DR4),死亡受体5(death receptor,DR5)表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示TRAIL(100 ng/ml)分别作用2、4、6、12 h后,CNE-1细胞中caspase-8 p43/p41,p18亚单位蛋白和caspase-3 p17,p10亚单位蛋白表达明显高于CNE-1-LMP1细胞,而Bcl-2相互作用域死亡激动蛋白的截短形式(truncated form of Bid,t Bid)和caspase-9 p35亚单位蛋白表达无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。JC-1线粒体膜电位检测法结果显示TRAIL干预后,线粒体膜电位无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。结论 LMP1过表达抑制TRAIL对鼻咽癌细胞的凋亡诱导作用和其细胞外凋亡信号的传导,提示LMP1是通过抑制细胞外信号通路激活诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗。

EB病毒潜伏膜蛋白1调控细胞凋亡的cDNA阵列分析

为探讨EB病毒潜伏膜蛋白 (LMP1)介导细胞凋亡和抑制细胞凋亡双重效应的机制 ,采用已建立的受四环素调控的LMP1表达的鼻咽癌细胞系 (pTet on LMP1HNE2 ) ,定量诱导 pTet on LMP1HNE2细胞LMP1动态表达 ,分别与含有细胞凋亡相关基因为主的AtlasapoptosiscDNAexpressionarray膜杂交 ,分析LMP1介导的表达差异基因。结果表明 :①LMP1介导细胞凋亡和抑制细胞凋亡的基因的表达 ,同时上调或下调某些与细胞凋亡相关基因的表达 ;②LMP1不仅介导细胞凋亡和抑制凋亡基因的表达 ,同时介导细胞分裂分化和增殖基因的表达 ,LMP1同时介导功能不同甚至功能相反的基因表达 ;③LMP1介导的基因表达与其表达持续时间和表达水平相关 ,不同表达水平和不同表达时间介导的基因表达谱不同。因此 ,LMP1具有介导细胞凋亡和抑制凋亡基因表达的双重生物学效应 ,同时介导细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等多种生物学效应基因的表达 ,从而参与细胞的癌变。

EBV反义LMP-1转染CNE2细胞对裸鼠致瘤的作用

目的研究反义LMP1基因转染CNE2细胞对裸鼠的成瘤作用。方法用反义LMP1转染的CNE2细胞、空载体转染的CNE2细胞以及原始CNE2细胞分别接种裸鼠,观察三种细胞的成瘤能力及细胞的恶性程度。结果反义LMP1转染的CNE2细胞比空载体转染的CNE2细胞及原始CNE2细胞在裸鼠体内成瘤能力(包括平均瘤重及总瘤重)和镜下细胞恶性程度都有所降低。结论反义LMP1能成功抑制LMP1的表达,逆转NPC细胞的恶性表型,为临床应用反义技术进行鼻咽癌基因治疗提供了实验依据。

EB病毒感染与hMLH_1蛋白表达在子宫颈癌发病中的意义

目的:了解宫颈癌Epstein-Barr病毒(EBV)感染情况及错配修复基因hMLH1表达在宫颈癌发生、发展中的意义。方法:采用免疫组织化学SP法检测临床资料较完整的72例子宫颈鳞癌和31例慢性宫颈炎组织EBV潜伏期膜蛋白(LMP1)与hMLH1蛋白表达,并分析二者的相关关系。结果:在宫颈炎及宫颈癌组EBV(LMP1)的表达率分别为90·3%(28/31)和69·4%(50/72),差异显著(P<0·05);hMLH1的表达率分别为61·3%(19/31)和58·3%(42/72),无显著差异(P>0·05);EBV感染组和非EBV感染组hMLH1的表达率分别为67·5%(54/80)和43·5%(10/23);差异显著(P<0·05);EBV(LMP1)和hMLH1的表达率与宫颈癌的分级、分期及淋巴结转移均无明显相关关系(P>0·05);与是否绝经无明显相关关系(P>0·05)。结论:宫颈炎和宫颈癌EBV感染率均较高,宫颈炎患者宫颈上皮EBV感染可能为致宫颈癌的高危因素,有待于进一步证实。EBV感染时hMLH表达率增高,提示EBV感染引起的宫颈细胞基因突变增多可能为EBV的致癌机制之一。

鼻咽癌患者EBV LMP1基因C端区的缺失突变及序列分析

目的 研究LMP1基因C端区缺失突变在我国南方广东、广西鼻咽癌高发区的存在状况和探讨其在鼻咽癌中所起的作用。方法 采用聚合酶链反应技术 (PCR)扩增鼻咽癌患者鼻咽组织中LMP1基因的C末端 ,并对其进行了克隆和序列分析。结果 2 0份鼻咽癌组织标本中 ,有 17份扩增出特异性条带 ,阳性率为 85 % ,阳性个体中只有 1份未发生缺失。我们选择其中的 4份样品进行了克隆和序列分析 ,结果显示 ,4份样品均存在 3 0个碱基的缺失和某些位点的单点突变。结论 广东。

儿童淋巴瘤患者EBV-LMP1基因C末端30bp缺失突变检测

目的研究儿童淋巴瘤来源的EBV-LMP1基因C末端30bp缺失突变情况并分析其意义。方法应用巢式聚合酶链反应技术（Nested-PCR）扩增免疫组化检测EBV-LMP1或原位杂交检测EBV-EBERS阳性的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和淋巴结反应性增生病理标本中EBV-LMPI基因，并进行序列分析。结果EBV-LMP1羧基端30bp缺失的del-LMP1的检出率在霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和淋巴结反应性增生分别为11／25、3／8和5／15，三组间差异无统计学意义（P=0．793，X^2=0．463）。经序列分析发现，所扩增的EBV-LMP1基因型可分为三个亚型：B95．8、China1和China2。结论EBV羧基端30bp缺失的del-LMP1基因型广泛存在EBV阳性的儿童霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和淋巴结反应性增生病例中，与疾病本身没有关系。儿童来源的EBV-LMP1基因型主要可分为B958、China1和China2三个亚型。