创伤性脑损伤大鼠皮质神经元中Lnx1表达及参与继发性脑损伤的机制

背景:细胞凋亡在继发性脑损伤中发挥重要作用。探究创伤性脑损伤后促进神经细胞存活的病理生理机制,将为防治创伤性脑损伤提供新的方向和理论依据。目的:探究Lnx1分子在哺乳动物脑损伤后皮质神经元中的表达变化及参与继发性脑损伤的可能机制。方法:80只成年SD大鼠平均分成假手术组和创伤性脑损伤组,每组雌雄各20只。采用重物坠落方法建立创伤性脑损伤大鼠模型,分别在脑损伤后6,12,24,48,72 h,通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光染色等技术分析相关分子在受损皮质神经元中的表达情况。结果与结论:(1)创伤性脑损伤组大鼠损伤部位脑组织出血,可观察到明显的组织损伤,脑组织含水量升高;(2)与假手术组相比,创伤性脑损伤组皮质神经元中Lnx1表达在损伤24 h开始显著升高;(3)创伤性脑损伤后与Lnx1相结合的PBK和BCR蛋白表达降低,促存活因子ctgf的表达升高;(4)结果表明:脑损伤后神经元中Lnx1表达上调,其通过降低靶分子PBK和BCR的表达,进一步上调促成活因子ctgf的表达,对受损神经元具有保护作用。

泛素连接酶LNX1促进外源PBK的泛素化和降解

目的研究LNX1对其相互作用蛋白PBK的泛素化和降解。方法克隆、原核表达、纯化了一系列重组人LNX1截断体蛋白和LNX1全长蛋白;在体外泛素化体系中研究其对PBK的泛素化,哺乳动物细胞内研究其对外源PBK的泛素化和降解。结果在体外泛素化体系中LNX1泛素化PBK,并研究了不同LNX1截断体对PBK泛素化的影响;发现在哺乳动物细胞内外源LNX1促进外源PBK的泛素化,进而导致其通过蛋白酶体降解。结论研究发现了LNX1对外源PBK的泛素化和降解,为研究LNX1的生理功能提供了重要线索。

泛素连接酶LNX1的表达、活性测定和功能初探

目的:在大肠杆菌中表达重组人泛素连接酶LNX1,并研究其对钾离子通道蛋白Kv1.4的泛素化作用。方法:构建人LNX1重组蛋白原核表达载体pGEX-LNX1,在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经GSTrap FF纯化,并通过体外泛素化(in vitroubiquitination)方法测定其泛素连接酶活性,同样用体外泛素化方法研究其对含有Kv1.4的C端的人工底物的泛素化。结果:获得了纯化的有泛素连接酶活性的重组人LNX1蛋白,重组LNX1可以在体外泛素化体系中泛素化含有Kv1.4的C端的人工底物。结论:重组人LNX1原核表达成功,具有泛素连接酶活性,并催化Kv1.4的泛素化。

LNX1通过调控TIAM1/ERK信号通路抑制肾透明细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移

目的:探讨泛素链接酶LNX1(ligand of numb-protein X 1)对肾透明细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其可能的分子作用机制。方法:利用基因表达谱交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)数据库分析LNX1 mRNA在肾透明细胞癌组织中的表达水平,及其与肾透明细胞癌患者预后的相关性。采用慢病毒感染的方法将携带特异性针对LNX1基因的shRNA(shLNX1)转入肾透明细胞癌细胞786-O和ACHN中;采用瞬时转染的方法将重组质粒flag-LNX1转入786-O和ACHN细胞中。分别采用CCK-8实验和细胞集落形成实验检测沉默或过表达LNX1对786-O和ACHN细胞增殖能力的影响,Transwell小室实验检测沉默或过表达LNX1对786-O和ACHN细胞侵袭和迁移能力的影响。采用生物信息学分析法筛选LNX1的下游靶基因,采用蛋白质印迹法检测沉默或过表达LNX1对T淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1(T-lymphoma invasion and metastasis-inducing protein 1,TIAM1)及其下游ERK信号通路中ERK及其磷酸化蛋白表达水平的影响。用蛋白酶体抑制剂MG132处理过表达LNX1的786-O和ACHN细胞,并且蛋白质印迹法检测TIAM1蛋白的表达水平。最后在过表达LNX1的细胞中同时转入重组载体myc-TIAM1,再用蛋白质印迹法、细胞集落形成实验和Transwell小室实验检测ERK信号通路中各蛋白的表达水平,以及同时过表达LNX1和TIAM1对786-O和ACHN细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果:肾透明细胞癌组织中LNX1 mRNA的表达水平降低(P<0.05),其表达水平与患者的生存时间呈正相关(P<0.001)。成功构建沉默LNX1基因的786-O和ACHN细胞,以及过表达LNX1的786-O和ACHN细胞。沉默LNX1基因后,786-O和ACHN细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显增强(P均<0.05);过表达LNX1后,786-O和ACHN细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显减弱(P均<0.05)。生物信息学分析发现TIAM1为LNX1的潜在靶蛋白。沉默LNX1基因后,TIAM1和磷酸化ERK(phospho-ERK,p-ERK)蛋白的表达水平明显升高(P均<0.05),而ERK蛋白的表达水平不变;过表达LNX1后,TIAM1和磷酸化ERK蛋白的表达水平明显降低(P均<0.01),而ERK蛋白的表达水平未发生变化。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理过表达LNX1的786-O和ACHN细胞后,TIAM1蛋白的表达水平升高(P<0.01和P<0.001)。在过表达LNX1的细胞中转入myc-TIAM1质粒后,p-ERK蛋白的表达水平升高,细胞的增殖、侵袭和迁移能力增强(P均<0.05),而ERK蛋白的表达水平不变。结论:LNX1通过降解TIAM1,进而调节ERK的磷酸化,最终抑制肾透明细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

LNX1基因的研究

LNX1基因编码的蛋白质含有2个异形体(isoform),分别称为LNX1-p70和LNX1-p80,其中LNX1-p80具有E3泛素连接酶活性。LNX1蛋白异形体都含有一个NAPY结构域和4个PDZ结构域,其中PDZ结构域是多种蛋白质中具有的结构,主要介导蛋白质相互作用。LNX1可以和细胞中多种蛋白质相互作用,改变被结合蛋白质在细胞中的数量与位置,参与调节生物体胚胎发育,在细胞紧密接界的重构中具有重要作用,可能对肿瘤的形成具有阻抑作用。

绕开极限——谈两个不等式在函数估值中的应用

本文试从两个常见的不等式入手对函数进行估值从而判断函数图象的走势，达到了绕开极限方法的目的．

e^x≥x+1与lnx≤x-1的应用

波利亚曾说:掌握数学就是意味着善于解题。灵活运用两个不等式e^x≥x+1,lnx≤x-1可以另辟蹊径,有效避免多次求导和复杂的分类讨论,往往可产生四两拨千斤的效果。