新疆葡萄酒中的酚类物质对LO2细胞自噬的影响

为了探究新疆葡萄酒酚类物质对肝细胞自噬的影响,该研究使用体外培养的人正常肝细胞(LO2),通过免疫印迹、实时荧光定量、细胞免疫荧光、流式细胞术等方法观察LO2细胞中微管相关蛋白1A/1B-轻链3(microtubule-associated proteins 1A/1B light chain3,LC3)和螯合体1(sequestosome 1,P62)的水平变化,初步评估新疆葡萄酒中酚类物质对LO2细胞自噬的影响作用。免疫印迹结果发现,橙皮苷、表儿茶素没食子酸酯,可显著提升LO2细胞中LC3蛋白的表达水平,提示橙皮苷和表儿茶素没食子酸酯或对LO2细胞自噬活性有一定影响作用。进一步通过实时荧光定量方法观察橙皮苷和表儿茶素没食子酸酯对LC3和P62蛋白mRNA的影响作用发现,橙皮苷、表儿茶素没食子酸酯处理细胞后,显著上调了LC3蛋白的mRNA水平,同时降低了P62蛋白的mRNA水平;细胞免疫荧光染色显示橙皮苷、表儿茶素没食子酸酯处理LO2细胞后,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)标记的LC3蛋白荧光强度增强,提示细胞内形成自噬小体;流式细胞术结果进一步发现,GFP-LC3/RFP-LC3荧光强度比值减小,表明自噬小体成熟。综上所述,橙皮苷、表儿茶素没食子酸酯对LO2细胞自噬活性具有一定的促进作用,但其作用机理尚需要进一步深入研究。

POR基因敲除、回补及过表达LO2细胞株的构建及作为AFB_(1)染毒模型的初步应用

为了构建POR基因稳定敲除(POR^(KO))、回补(PORCO)、过表达(POR^(OE))的LO2细胞株,以便为后续深入开展POR基因在AFB_(1)致毒性机理中的功能研究提供细胞模型。本研究首先利用CRISPR/Cas9技术设计2条靶向POR基因的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体,进行慢病毒包装与感染,筛选出LO2 POR^(KO)单克隆细胞后进行测序及Western blot鉴定。其次用同源重组方法构建pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重组质粒,经对POR^(KO)细胞和野生型细胞转染分别构建LO2 PORCO及LO2 POR^(OE)细胞株,以G-418筛选后进行Western blotting鉴定。再用4μmol·L^(-1)及8μmol·L^(-1)AFB_(1)分别对野生型、LO2 POR^(KO)、LO2 PORCO、LO2 POR^(OE)细胞株染毒48 h,观察细胞形态并测定细胞存活率。结果表明,靶向exon5的sgRNA-2可成功敲除POR基因,得到LO2 POR^(KO)细胞株;成功构建表达POR重组蛋白的LO2 PORCO及LO2 POR^(OE)细胞株。对AFB_(1)处理后的各细胞存活率测定结果表明,相较于野生型LO2细胞43.66%±0.58%和27.90%±0.46%的存活率,LO2 POR^(KO)细胞存活率具有极显著性差异,均为100%(P<0.0001);LO2 PORCO细胞存活率仍有显著性差异,分别为57.07%±0.74%和42.54%±0.68%(P<0.05);LO2 POR^(OE)细胞存活率则显著降低,分别为24.58%±0.92%和17.99%±0.81%(P<0.01)。综上所述,本研究成功构建了LO2 POR^(KO)、LO2 PORCO、LO2 POR^(OE)细胞株,并以AFB_(1)染毒处理分别研究了各细胞株的存活率和细胞形态学变化,发现POR基因对AFB_(1)所致细胞毒性的影响巨大。研究结果为后续深入开展POR基因在AFB_(1)致毒性机理中的功能研究奠定了基础。

基于脂肪变性细胞模型研究明桑降脂茶调控LO2细胞脂代谢的作用

目的明确明桑降脂茶的降脂作用及其发挥降脂作用的物质基础。方法制备大鼠空白血清、明桑降脂茶全方和桑叶减味含药血清,以油酸诱导人正常肝细胞(LO2细胞)建立脂肪变性细胞模型,将细胞分为对照组(含空白血清)、模型组(含空白血清)、明桑降脂茶全方血清处理组、桑叶减味血清处理组。培养4 h后,显微镜下观察各组脂肪积累情况;酶标仪测定细胞内脂质含量;按试剂盒说明测定细胞内甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(totalcholesterlo,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量,以及过氧化物酶体增殖物启动受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPARα)、固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP-1c)表达。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)研究各组指纹图谱、绿原酸和橙黄决明素含量的差异。结果与模型组比较,明桑降脂茶全方血清组、桑叶减味血清组均能显著降低细胞内脂滴数量和脂质含量,降低TG、TC、LDL-C含量和SREBP-1c表达,升高HDL-C含量和PPARα表达,全方血清组的降脂作用优于桑叶减味血清组;全方血清组、桑叶减味血清组、空白血清组共有峰分别为53、35、23个,三者共有峰18个;剔除共有峰后,全方血清组有22个不同于桑叶减味血清组的差异峰,桑叶减味血清组有4个不同于全方血清组的差异峰;全方血清组中绿原酸和橙黄决明素含量均高于桑叶减味血清组,绿原酸含量在二者之间差异显著。结论明桑降脂茶具有明显的降脂作用,桑叶在其中发挥重要降脂作用。

三白草中化学成分对H_2O_2损伤LO2细胞保护作用

目的研究三白草中主要化学成分对H2O2损伤人正常肝细胞LO2的保护作用。方法供试品为三白草中木脂素类成分:Rel-(7S,8R,7’R,8’R)-3,3’,4,4’,5,5’-hexamethoxy-7-O-7’,8,8’-llignan、Di-O-methyltetra hydrofuriguaiacin B、里卡灵A、里卡灵B、三白草素、二氢愈创木酸;黄酮类成分:异槲皮苷、槲皮苷。LO2细胞接种于96孔板培养,加入100μmol/L的受试成分,培养24h后加入20μL 1.2mmol/L H2O2作用1h。使用MTT法检测各组细胞存活率。结果异槲皮苷和槲皮苷对H2O2损伤LO2细胞有显著保护作用,里卡灵A和二氢愈创木酸对细胞有显著损伤作用。结论该实验可以为三白草保肝作用的研究提供理论基础。

九香虫防御性物质水溶液成分分析及其对LO2细胞活性的影响

研究了九香虫的防御性物质水溶液中挥发性成分及其相对百分含量,以及该水溶液对人肝LO2细胞活性的研究。采用温水浸泡法获得九香虫的防御性物质水溶液;GC-MS获得该水溶液的挥发性成分组成,并用面积归一法计算各成分的相对百分含量;利用MTT法、流式细胞术研究该水溶液对LO2细胞的影响。研究表明,九香虫防御性物质水溶液中挥发性成分包含19种化合物,其中相对百分含量最高的为反-2-己烯醛(88.54%),其次为2-甲基-4-戊烯醛(5.16%)、十三烷(3.43%)等;该水溶液作用LO2细胞后,IC50为3.64μL,呈剂量依赖性;细胞周期结果显示,G2/M期细胞比例明显降低,而G0/G1期细胞比例明显升高,且差异具有统计学意义。九香虫防御性物质水溶液成分主要是烯醛和烷烃类化合物;该物质能够抑制人肝LO2细胞的体外增殖,可能与其细胞周期阻滞有关。

厄贝沙坦激活PPAR-γ介导AMPK/mTOR通路诱导自噬改善LO2细胞脂肪变

目的探讨厄贝沙坦调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)介导磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路及自噬对LO2细胞脂肪变的影响。方法采用脂混合物(LM)诱导LO2细胞建立细胞脂肪变模型,将造模后细胞分为模型组、厄贝沙坦组和厄贝沙坦联合PPAR-γ抑制剂组,另设正常组。分别干预24 h后,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)含量,并行油红O染色分析细胞内脂质沉积,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞PPAR-γ、AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达,应用激光共聚焦技术观察自噬标志蛋白LC3B的变化。结果10μmol/L及以下浓度的厄贝沙坦对LO2细胞生长无明显毒性作用,20μmol/L厄贝沙坦对细胞毒性作用较大,表现出明显的抑制作用。与正常组比较,模型组LO2细胞内TG和TC含量升高,油红O染色显示脂质大量沉积,PPAR-γ、p-AMPK和LC3B蛋白表达水平降低,mTOR磷酸化水平升高(均P<0.05);与模型组比较,经厄贝沙坦治疗后,LO2细胞内TG和TC含量降低,油红O染色显示脂质沉积减少,PPAR-γ、p-AMPK和LC3B蛋白表达水平升高,mTOR磷酸化水平降低(均P<0.05);但经厄贝沙坦联合PPAR-γ抑制剂干预后,PPAP-γ抑制剂抑制了厄贝沙坦对LO2细胞脂肪变的治疗作用。结论厄贝沙坦可通过激活PPAR-γ介导的AMPK/mTOR信号通路,促进LM诱导LO2细胞的自噬,从而减轻脂质沉积,改善肝细胞脂肪变。

三黄茵赤方含药血清对LO2细胞DNA氧化损伤的影响

目的探讨三黄茵赤方含药血清对H2O2诱导LO2细胞DNA氧化损伤的保护作用。方法采集三黄茵赤方含药血清,以LO2细胞株为研究对象,通过H2O2诱导LO2细胞DNA氧化损伤模型,实验分正常对照组、H2O2模型组、三黄茵赤方含药血清5%、10%、15%浓度组、维生素E组,采用倒置显微镜观察各组形态,CCK-8法测定细胞存活率,生化法检测细胞内SOD、CAT和GSH-PX活性,流式细胞仪检测细胞内ROS水平,ELISA检测细胞内8-OHd G含量,彗星实验检测细胞DNA损伤情况。结果与H2O2模型组比较,三黄茵赤方含药血清10%、15%浓度组、维生素E组均能提高细胞存活率(P<0.05),增强细胞内SOD、CAT、GSH-PX活性(P<0.05),改善细胞对ROS清除能力(P<0.01),降低细胞内8-OHd G含量(P<0.01),减低细胞拖尾率、尾长、尾矩及Olive尾矩(P<0.05)。结论三黄茵赤方含药血清对H2O2诱导LO2细胞DNA氧化性损伤具有保护作用,以15%浓度含药血清组作用最显著。

狭基线纹香茶菜水溶性总黄酮对H2O2致LO2细胞损伤的保护作用

目的:探讨狭基线纹香茶菜水溶性总黄酮(WSTF)对氧化应激损伤LO_2细胞的保护作用。方法:通过细胞毒性实验确定给药范围,建立过氧化氢(H2O_2)致LO_2细胞损伤模型,用含不同浓度WSTF的培养液与急性损伤肝细胞共孵育不同时间,采用MTT比色法测定细胞活力,检测谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙二醛(MDA)的水平,评价WSTF对肝细胞损伤的保护作用。检测细胞线粒体膜电位和细胞内活性氧簇(ROS)水平,分析WSTF抑制H2O_2诱导LO_2细胞凋亡情况。结果:0.3 mmol·L^(-1)H2O_2处理LO_2细胞4 h构建H2O_2损伤LO_2细胞模型,确定0.031 2~0.125 mg·ml^(-1)WSTF为保护LO_2细胞损伤的给药浓度范围。WSTF可抑制H2O_2对肝细胞的损伤,并明显降低H2O_2致急性损伤肝细胞的ALT、AST释放量和MDA水平,逆转H2O_2诱导LO_2肝细胞线粒体膜电位去极化和细胞内ROS升高。结论:WSTF体外给药对肝细胞损伤有保护作用。

LO2细胞不同缺氧复氧时间细胞存活率检测及瘦素的影响

【目的】复制肝细胞缺血缺氧模型和瘦素对它的影响。【方法】将LO2细胞分别缺氧2h、4h、8h和12h和正常组,后用CCK-8检测各组细胞的A490值,与正常组比较算出细胞的存活率。并用不同浓度的瘦素(分别为100μg/L、200μg/L、400μg/L、800μg/L和1600μg/L)加入缺氧12h的LO2细胞,观察瘦素对其细胞存活率的影响。【结果】LO2细胞经厌氧培养后,缺氧2h、4h、8h和12h细胞CCK-8A490值显著低于缺氧正常组平均值(P<0.01),随着缺氧时间的延长,A490值、细胞存活率逐渐下降;经厌氧培养后的LO2细胞与正常组相比,细胞CCK-8A490值显著低于对照组(P<0.01),不同浓度的LEP能减轻厌氧培养的LO2细胞损伤,A490值、细胞存活增高。【结论】采用厌氧气体培养LO2细胞复制肝脏缺血模型是可行的;瘦素对经厌氧培养后的LO2细胞有保护作用。

Pdx1与Ngn3协同诱导LO2细胞分化为胰腺β样细胞

目的:胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pdx1)与神经源素3(Ngn3)联合诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化。方法:以人胚胎胰腺组织基因组的mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1与Ngn3基因。应用分子生物学技术,分别克隆到真核表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建pEGFP-C1/Pdx1与pEGFP-C1/Ngn3真核表达质粒,并共转染L02细胞,用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法检测目的基因及胰岛素相关基因葡萄糖转运体2(GLUT2)与胰岛素的表达情况。结果:目的基因克隆正确,RT-PCR、免疫组化、间接荧光证实转染后LO2细胞中有Pdx1、Ngn3和胰岛素及胰岛素相关基因GLUT2的表达。结论:Pdx1与Ngn3协同作用可诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化。

玉米糖肽对酒精诱导损伤LO2细胞的保护效应

构建LO2细胞酒精性损伤模型,在细胞水平上研究玉米糖肽干预对酒精诱导损伤的LO2细胞的保护效应,并探讨玉米糖肽拮抗酒精性肝细胞损伤的可能机理。结果表明:与酒精模型组相比,50μg/mL玉米糖肽的预处理能够增加损伤LO2细胞中酒精代谢酶(ADH和ALDH)和抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)活力以及GSH含量;降低ROS和MDA含量,说明玉米糖肽通过促进酒精代谢和增强抗氧化活力,维持LO2细胞结构的完整,防止肝内酶(AST、ALT和LDH)的泄露,并降低LO2细胞早期凋亡和死亡细胞的比例,达到保护酒精诱导损伤的LO2细胞的效果。

S1P对人LO2肝细胞株胰岛素抵抗模型糖代谢的影响

目的观察鞘氨醇激酶1(SPK1)催化产物1-磷酸鞘氨醇(S1P)对LO2肝细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的影响。方法用胰岛素诱导人正常肝细胞(LO2)产生胰岛素抵抗,MTT法检测LO2细胞增殖,葡萄糖-己糖激酶法检测培养基残存葡萄糖浓度,油红O鉴定LO2细胞脂肪变性,荧光双染法鉴定线粒体ROS,Western blot检测SPK1蛋白表达。结果与对照组相比,10、100和1 000 nmol/L 3个浓度的胰岛素对细胞葡萄糖摄取能力无显著影响;1 000 nmol/L浓度的胰岛素作用细胞48 h时胰岛素敏感指数下降,胰岛素抵抗模型建立。与对照组相比,模型组细胞脂滴面积增加(P<0.05),SPK1表达量呈增加趋势,线粒体ROS也显著增加。在模型组中加入S1P后,可显著促进细胞对葡萄糖的吸收(P<0.05)。结论成功构建胰岛素诱导的LO2肝细胞胰岛素抵抗模型,并且发现S1P可以促进模型细胞糖代谢,提示S1P可作为筛选降糖药物的新靶点。

清肝降脂方对脂肪变性LO2细胞HO-1、Egr-1基因及蛋白表达的影响

目的:通过建立游离脂肪酸体外诱导的LO2细胞非酒精脂肪肝模型,探讨不同剂量的清肝降脂方对肝脏脂肪变LO2细胞HO-1、Egr-1基因及蛋白表达水平的影响。方法:建立游离脂肪酸诱导脂肪变性LO2肝细胞体外模型。人肝LO2细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养,待细胞均匀分布,随机分为6组:正常对照组、模型组、清肝降脂方高剂量组、中剂量组、低剂量组、水林佳对照组,每组6瓶。除正常对照组外,其余5组细胞均以0.5 mmol/L的游离脂肪酸诱导LO2非酒精脂肪肝细胞模型,诱导24 h后,各组随机抽取1瓶进行油红O染色,观察LO2细胞的脂肪化程度。确定模型诱导成功后,正常对照组和模型组分别加入10%正常大鼠血清,低、中、高剂量清肝降脂方药物血清组及水林佳药物血清组添加10%含相对应药物的大鼠血清,培养24h后,收集细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测血红素氧化酶-1(HO-1)、早期生长反应因子-1(Egr-1)的基因及蛋白表达水平。结果:与正常对照组比较,模型对照组LO2细胞HO-1、Egr-1 mRNA和蛋白表达有所增加;与模型对照组比较,自拟清肝降脂方三剂量组和对照药物组HO-1 mRNA及蛋白表达有所增高,Egr-1mRNA和蛋白表达明显降低;与对照药物组比较,清肝降脂方高剂量组HO-1 mRNA表达有所增高,Egr-1 mRNA表达有所降低。结论:Egr-1高表达可能会导致肝损伤机制之一;HO-1高表达可能是保护肝损伤机制之一;两者可能都是通过调节TNF-α表达来调节NAFLD细胞的损伤进展。清肝降脂方可明显改善LO2细胞Egr-1、HO-1 mRNA及蛋白的表达,可能为其治疗机制、临床诊断和判断进展参考指标。

人肝细胞系LO2单纯肝脂肪变性细胞模型的建立

目的:探讨建立人肝细胞系LO2单纯肝脂肪变性细胞模型的方法。方法:试验分为正常对照组与试验组,用含10%胎牛血清的1640培养基培养LO2细胞,当细胞处于对数生长期时,正常对照组更换新鲜的1640培养基,试验组用含不同浓度游离脂肪酸(油酸∶棕榈酸为2∶1)的1640培养基培养,24 h后油红O染色,观察细胞内脂滴大小,并检测细胞中TG、TC含量的变化及细胞增殖情况。结果:试验组中LO2细胞内有大量的脂滴生成,且甘油三酯水平显著升高,其中,以1.2 mM FFA组脂质沉积最为明显。同时,细胞抑制率小于4%,胆固醇水平无明显升高,均符合单纯脂肪变性模型的特征。结论:采用游离脂肪酸(油酸∶棕榈酸为2∶1)可以成功诱导LO2细胞单纯脂肪变性,其中游离脂肪酸浓度以1.2 m M最为理想。

油茶皂苷对LO2和HK-2细胞的毒性作用研究

目的：观察油茶皂苷（SQS）对人正常肝细胞（L02）和肾小管上皮细胞（HK-2）的细胞毒性作用，并初步探讨其毒性作用机制。方法：体外培养L02和HK-2细胞，采用MTr法评价SQS对L02和HK-2细胞的增殖抑制作用，观察不同浓度药物对乳酸脱氢酶（LDH）释放率的影响，并检测细胞裂解上清液超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量。结果：与阴性对照组比较，各浓度的SQs均可明显抑制L02和HK-2细胞增殖（P＜0．01），且呈浓度依赖性。在50．0～200．0mg／L范围内，SQS能明显提高L02和HK-2细胞培养上清液LDH活力（P＜0．05或P＜0．01），显著降低SOD的活力和增加MDA的含量（P＜0．01）。结论：SQS对L02和HK-2细胞有一定的细胞毒性作用，其作用机制可能是通过增加对细胞膜通透性的影响及氧化损伤而实现。

瓜子金基于HMG-COA/SREBP/LXRa通路的LO2细胞脂代谢研究

目的:探索瓜子金不同萃取部位在体外对人正常肝细胞(LO2)脂代谢的影响.方法:建立LO2高胆固醇、高甘油三酯模型,利用酶标仪比色法考察不同萃取部位对LO2细胞内胆固醇、甘油三酯的影响,利用Western-Blot考察不同萃取部位对HMG-COA还原酶、SREBP-2、LXRa蛋白表达的影响.结果:二氯甲烷部位(Ⅱ)和正丁醇部位(Ⅲ)能显著降低LO2细胞中胆固醇及甘油三酯的含量(P<0.05);进一步的Western-Blot结果表明,在高胆固醇模型中,Ⅱ部位和Ⅲ部位均可显著降低细胞中HMG-COA还原酶蛋白的表达,Ⅱ部位对SREBP-2蛋白和LXRa的影响无显著性差异,Ⅲ部位则表现出降低SREBP-2而升高LXRa的作用;在高甘油三酯模型中,Ⅱ部位和Ⅲ部位均对HMG-COA无影响,但均可降低SREBP-2的表达,另Ⅱ部位降低LXRa的表达呈显著性差异.结论:瓜子金二氯甲烷部位和正丁醇部位可干预LO2细胞的胆固醇、甘油三酯代谢,并且可能是通过调节SREBP-2/HMG-COA/LXRa的表达而实现的.

RBP4分子RNAi载体的制备及对人肝细胞系LO2中ERK信号通路的影响

目的制备人视黄醇结合蛋白4(RBP4)分子RNAi载体,检测其干涉人肝细胞系LO2中RBP4的表达后对ERK1/2表达及磷酸化和葡萄糖摄取的影响。方法分别构建针对RBP4基因表达框5'端和3'端的干涉载体及真核表达载体,经测序和酶切鉴定后将载体转染LO2,RT-PCR和Western blot法确定其干涉RBP4表达的效率,选择干涉较高的载体用于后续实验;Western blot检测ERK1/2的表达及磷酸化水平的改变,葡萄糖氧化酶法检测上清液中葡萄糖的残留量。结果构建的真核表达载体和干涉载体经酶切、测序鉴定结果正确,并有明显的高表达或干涉效果。Western blot结果表明ERK1/2的表达量无明显变化,RBP4高表达组其磷酸化显著下降,RBP4干涉组其磷酸化显著上升。胰岛素刺激后RBP4高表达组的葡萄糖摄取明显下降,RBP4干涉组的葡萄糖摄取明显增加。结论成功制备RBP4基因的干涉载体并应用于LO2细胞中ERK1/2通路的研究,为后续RBP4的进一步功能研究奠定基础。

解毒化瘀颗粒对H_(2)O_(2)诱导LO2肝细胞炎症反应的影响

目的研究解毒化瘀颗粒对H_(2)O_(2)诱导LO2肝细胞损伤炎症反应的影响及其可能的作用机制,为慢加急性肝衰竭的防治提供理论基础。方法利用H_(2)O_(2)诱导LO2肝细胞损伤模型,用不同浓度解毒化瘀颗粒工作液进行干预,采用Hochest 33528染色观察细胞形态,Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡,RT-PCR检测细胞中炎症因子白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)及Toll样受体4(Toll-like Receptors 4,TLR4)mRNA水平,Western blot检测信号通路蛋白磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylation-mitogen activated protein kinase,p-MAPKs)、磷酸化核转录因子κB(phosphorylation-nuclear factor kappa B,p-NF-κB),TLR4的表达水平。结果与对照组相比,经H_(2)O_(2)处理后,LO2细胞凋亡率明显上升(P<0.01),炎性因子IL-6、TNF-αmRNA水平显著升高(P<0.01),TLR4 mRNA水平亦显著升高(P<0.01)。p-MAPKs、p-NF-κB、TLR4的蛋白表达水平则显著降低(P<0.01)。经解毒化瘀颗粒工作液干预后,细胞凋亡率显著下降(P<0.01),炎性因子IL-6、TNF-αmRNA水平显著降低(P<0.01),TLR4 mRNA水平亦显著降低(P<0.01)。p-MAPKs、p-NF-κB、TLR4的蛋白表达水平则显著升高(P<0.01)。结论解毒化瘀颗粒对H_(2)O_(2)诱导LO2肝细胞的炎症反应具有保护作用,其机制可能与TLR/MAPKs/NF-κB信号通路有关。

索拉非尼在HepG2与LO2细胞的摄取动力学

目的探讨索拉非尼在肝癌细胞(HepG2)与正常肝细胞(LO2)的摄取动力学特性。方法取正常培养的处于对数期的HepG2与LO2细胞株,加入含索拉非尼系列浓度的培养液,孵育后处理细胞,检测索拉非尼及细胞蛋白浓度,分析摄取动力学参数。结果HepG2与LO2细胞对索拉非尼的摄取随着浓度的增加而趋于饱和,但与LO2细胞相比较,HepG2细胞对索拉非尼的摄取量明显增加。当加入10 mol·L^(-1)的索拉非尼,HepG2与LO2细胞对索拉非尼的摄取随着时间的增加而增加,均在20 min时趋于饱和。HepG2细胞的摄取动力参数V_(max)为(684.14±78.19)pmol·mg protein^(-1)·min^(-1),K_(m)为(93.3±17.56)μmol·L^(-1);LO2细胞的摄取动力参数V_(max)为(335.61±69.73)pmol·mg protein^(-1)·min^(-1),K_(m)为(135.68±29.34)μmol·L^(-1);结果显示HepG2细胞对索拉非尼的摄取速率明显高于LO2细胞。结论索拉非尼在肝癌细胞中摄取量及摄取速率明显高于正常肝细胞,对肝癌细胞具有一定的靶向性。

肝细胞LO2中细胞因子诱导的含CISH基因的表达及其炎性因子调控的研究

目的建立SH2结构域蛋白(cytokine inducible SH2-containing protein,CISH)基因上、下调的肝细胞模型,探讨CISH基因在正常肝细胞中的表达及其对炎性因子的调控。方法实验组分别为转染CISH siRNA组和CISH过表达质粒组,对照组分别为转染空质粒的阴性对照组和未转染任何物质的空白对照组;分别用CISH siRNA和CISH过表达质粒借助lipo 2000转染肝细胞LO2构建CISH基因表达的上、下调肝细胞模型;采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法(Western Blot)分别检测肝细胞LO2中CISH基因在mRNA和蛋白水平的变化;利用ELISA法检测LO2肝细胞中CISH基因表达水平改变后对炎症因子TNF-α、IL-1β水平的影响。结果实时荧光定量PCR和Western Blot法检测表明,与未转染的LO2肝细胞比较,被转染CISH过表达质粒的细胞能够上调目的基因CISH的表达,被转染CISH siRNA的细胞可下调目的基因CISH的表达;ELISA法检测表明,与未转染的LO2肝细胞比较,被转染CISH过表达质粒的细胞分泌的炎症因子TNF-α和IL-1β水平表现出降低趋势,而被转染CISH siRNA的细胞分泌的炎症因子TNF-α和IL-1β水平则表现出升高趋势。结论成功构建了CISH高、低表达的LO2肝细胞系,CISH基因表达改变可影响LO2肝细胞系炎性因子的分泌。