魔芋葡甘露聚糖对镉所致的LO2细胞毒性损伤的影响

[目的]研究魔芋葡甘露聚糖(KGM)对镉导致的L02细胞毒性损伤的影响。[方法]MTT法确定KGM对L02细胞的最适作用浓度和无菌处理方式;设置空白对照组、镉单独作用组、镉先作用3 h再加KGM作用组、KGM先作用3 h再加镉作用组,分别培养不同时间段后用MTT法检测L02细胞活力;检测ALT、AST、GSH-Px、MDA水平,并在光镜下进行细胞形态观察。[结果]0.2mg/mL的KGM溶液经121℃30 min灭菌处理后最适作用于L02细胞;L02细胞活力与CdCl2浓度呈明显的剂量-效应关系;CdCl2与KGM联合作用后其细胞活力均高于镉单独作用组,且其ALT、AST、MDA的检测结果均呈极显著差异。[结论]KGM对镉染毒后的L02细胞有一定的保护作用。

脯氨酰寡肽酶抑制剂S17092对脂质超载人肝细胞株LO2脂质沉积的改善作用及其机制

目的观察脯氨酰寡肽酶(POP)抑制剂S17092对脂质超载人肝细胞株LO2脂质沉积的改善作用,并探讨其机制。方法将LO2细胞随机分为3组,对照组LO2细胞用1%无脂肪酸(FFA)的1640培养基培养,模型组LO2细胞用FFA制备脂质超载模型后再用1640培养基培养,实验组LO2细胞制备脂质超载模型后再加入含S17092的1640培养液培养。各组细胞继续培养24 h后,采用油红O染色法观察各组细胞内脂质沉积情况,采用Bio-Rad蛋白质测定法检测各组细胞内甘油三酯(TG),采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞内POP、固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)mRNA。结果油红O染色结果显示,与对照组相比,模型组LO2细胞内含有大量的红染颗粒,而实验组较模型组红染颗粒相对较少。对照组、模型组、实验组细胞内TG水平分别为(1.995±0.221)pmole/μL、(2.910±0.030)pmole/μL、(2.573±0.113)pmole/μL,组间相比,P均<0.05。与对照组相比,模型组、实验组细胞中POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA相对表达量明显升高(P均<0.05);与模型组相比,实验组细胞中POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA相对表达量明显降低(P均<0.05)。结论POP抑制剂S17092可改善脂质超载LO2细胞的脂质沉积,其机制可能与抑制SREBP-1c及其靶基因的表达有关。

MicroRNA在HepG_2肝癌细胞表达差异谱的研究

目的建立HepG2人肝癌细胞株与LO2正常肝细胞株microRNA(miRNA)表达的差异谱,为研究miRNA在肝细胞癌变机制中的作用提供新线索。方法体外培养HepG2人肝癌细胞和LO2人正常肝上皮细胞,Trizol法抽提细胞总RNA,Ambion′s miRNA Isolation Kit进一步分离miRNA;利用基因芯片技术,将细胞miRNA与哺乳动物miRNA芯片杂交,采用Lux-Scan3.0图像软件和SAM version 2.1进行数据分析。结果HepG2细胞与LO2细胞表达的miRNA中有146个存在着明显差异(fold change>4.0),其中80个低表达和66个高表达,最高fold change达36倍,部分miRNAs与肿瘤关系密切,其中has-miR-224为肝癌癌变相关miRNA。结论HepG2较LO2细胞miRNA低表达数多于高表达数,反映其基因表达数量更丰富,细胞代谢和增殖更活跃;部分miRNAs可能参与肝细胞癌变分子机制。

连翘苷对酒精性肝损伤的保护作用

目的:研究连翘苷对酒精性肝损伤的保护作用。方法:人正常肝细胞株LO2于高糖DMEM完全培养基中培养,CCK-8试剂盒检测细胞存活率;ALT活性检测试剂盒检测细胞培养液中ALT的活性;DAPI染色法于荧光倒置显微镜下观察细胞核形态的改变;Western blotting检测凋亡相关蛋白PARP、caspase 3的表达。结果:连翘苷浓度依赖性地减轻酒精诱导的肝细胞损伤;DAPI染色结果表明连翘苷能够显著逆转酒精诱发的肝细胞核浓缩及核碎裂现象,细胞凋亡相关蛋白PARP和caspase 3的表达也被显著抑制。结论:连翘苷通过抑制肝细胞凋亡在酒精性肝损伤中发挥保护作用。

死亡受体5在内毒素诱导人肝细胞凋亡中的作用

探讨内毒素(LPS)在体外直接作用于LO2细胞引起凋亡及可能机制。将LO2细胞常规培养7 h贴壁后,分为对照组、内毒素处理组、抗人DR5单抗mDRA-6处理组及联合组(内毒素+mDRA-6)。然后在倒置显微镜下观察LO2细胞形态变化;MTT法检测内毒素对LO2细胞生长的影响;流式细胞术检测LO2细胞表面DR5的表达率;Annexin-V和PI双染法检测细胞凋亡率。结果:经内毒素处理的LO2细胞呈现明显的凋亡形态特征,出现核固缩、染色质边缘化、凋亡小体形成。流式细胞术分析表明:对照组LO2细胞表面DR5的表达率为4.8%,用内毒素(10 mg/L)处理12 h后,DR5表达率上调为37.76%。LO2细胞12 h凋亡率:内毒素处理组、抗人DR5单抗mDRA-6处理组、内毒素联合mDRA-6组细胞凋亡率分别为37.78%(早期凋亡21.65%,晚期凋亡16.13%)、29.58%(早期凋亡18.21%,晚期凋亡11.37%)和65.81%(早期凋亡50.61%,晚期凋亡15.20%)(P<0.05)。细胞凋亡率与内毒素的剂量及细胞表面DR5的表达呈相关性。结论:LPS对LO2细胞的杀伤作用主要通过诱导凋亡,细胞表面DR5受体的表达上调可促进这种凋亡作用。

Hyper-IL-6融合基因重组腺病毒的构建及其在肝细胞中的表达

目的在扩增出融合基因Hyper-IL-6的基础上,构建重组腺病毒Ad-HIL-6。用Ad-HIL-6感染人肝细胞LO2,观察细胞内Hyper-IL-6 mRNA和蛋白的表达情况。方法将Hyper-IL-6克隆至穿梭质粒,线性化后与腺病毒骨架质粒在BJ5183细菌内同源重组,构建重组腺病毒质粒。线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,PCR进一步证实重组腺病毒的存在。RT-PCR检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6基因的表达情况,Western blot法检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6的蛋白表达情况。结果酶切及PCR鉴定表明同源重组成功,重组腺病毒质粒转染293细胞后可见绿色荧光,感染293细胞得到大量病毒。重组腺病毒Ad-HIL-6能在LO2细胞中表达出Hyper-IL-6基因和蛋白,条带分别为1600bp和60KD左右。结论重组腺病毒AdHIL-6构建成功,为以后进行基因治疗奠定基础。

FAH/GSTZ1双基因突变肝细胞模型的建立

目的采用CRISPR/Cas9技术敲除人LO2肝细胞系的谷胱甘肽S-转移酶Z1(GSTZ1)和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH),探讨GSTZ1和FAH基因敲除对于肝细胞生长、增殖、迁移的影响。方法分别构建靶向GSTZ1和FAH基因的向导RNA(sgRNA)载体,与CRISPR/Cas9载体共转染LO2细胞,通过有限稀释法筛选,基因型鉴定和Western blot实验证实获得的FAH和GSTZ1基因的单基因敲除和双基因敲除三种细胞株。进一步对敲除细胞株表型进行鉴定,通过平板克隆形成实验检测基因敲除肝细胞克隆形成能力;CCK8实验和EdU分析实验测试细胞增殖能力;划痕实验检测细胞迁移能力。结果成功获得GSTZ1、FAH和FAH/GSTZ1三种基因敲除细胞株。相比于野生型细胞,三种细胞株在增殖能力,克隆形成能力、迁移能力均有显著增加,其中FAH敲除对细胞表型的影响相对较小,GSTZ1敲除对肝细胞活性提高最强,双基因敲除细胞活性处于两个单基因敲除之间。结论我们首次成功建立了FAH/GSTZ1双基因突变肝细胞株,为酪氨酸代谢通路研究和Ⅰ型遗传性酪氨酸血症治疗研究提供了一个新型的细胞模型。

茵陈五苓散含药血清对LO2细胞株LDL-R及HMG-CoA还原酶表达的影响

目的探讨茵陈五苓散含药血清调节血脂的可能机制并筛选其最佳给药浓度及作用时间。方法将40只雄性SD大鼠随机分为菌陈五苓散低、中、高剂量组,辛伐他汀组及空白组,每组8只。菌陈五苓散低、中、高剂量组分别给予4、8、16 g/(kg·d)菌陈五苓散;辛伐他汀组给予1 mg/(kg·d)辛伐他汀片;空白组给予20 mg/(kg·d)生理盐水,各组大鼠每天灌胃2次,连续3天,制备含药血清。取对数生长期的LO2细胞株经过24 h孵化贴壁后随机分为茵陈五苓散低、中、高剂量组,辛伐他汀组及空白组,每组各18孔,每孔分别加入受试血清10μl。同浓度的18孔再分为3组,每组6孔,分别培养24、48、72 h,实时荧光定量法检测各组细胞的低密度脂蛋白受体(LDL-R)mRNA及3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶mRNA表达情况。结果与空白组比较,茵陈五苓散各剂量组及辛伐他汀组各时间点LDL-R mRNA表达均明显升高,HMG-Co A还原酶mRNA表达均明显下降(P<0.05或P<0.01),其中茵陈五苓散在中浓度、干预48 h的条件下LDL-R mRNA表达达高峰、HMG-Co A还原酶mRNA表达最低。结论茵陈五苓散含药血清调节血脂的机制可能与其能明显上调LDL-R表达、下调HMG-Co A还原酶表达有关,在药物浓度为中浓度、干预时间为48 h时效果最佳。

3种温阳健脾汤药对非酒精性脂肪肝细胞增殖与凋亡的影响

通过油酸诱导正常肝细胞株LO2构建非酒精性脂肪肝细胞模型,探讨四君子汤、理中汤和附子理中汤对非酒精性脂肪肝细胞增殖与凋亡的影响。不同浓度的油酸诱导正常肝细胞株LO2构建非酒精性脂肪肝细胞模型,油红O染色观察非酒精性脂肪肝细胞的脂滴形成状况;全自动生化分析仪检测细胞上清液中天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平。分别设正常组、模型组、模型+四君子汤组、模型+理中汤组和模型+附子理中汤组,MTT检测各组细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;Western blot检测各组细胞中PCNA,cleaved caspase-3,cleaved caspase-8,cleaved caspase-9,Bax和Bcl-2蛋白的表达情况。油红O染色结果显示,与低浓度诱导相比,80 mg·L^(-1)油酸诱导非酒精性脂肪肝细胞模型效果最佳,且诱导成功后细胞上清液中AST,ALT,TC和TG含量显著升高(P<0.01)。MTT和流式细胞仪检测结果显示,四君子汤、理中汤和附子理中汤均能有效促进非酒精性脂肪肝细胞的增殖并抑制其凋亡(P<0.01),且附子理中汤的作用效果最佳。Western blot检测结果显示,四君子汤、理中汤和附子理中汤能下调非酒精性脂肪肝细胞中cleaved caspase-3,cleaved caspase-8,cleaved caspase-9和Bax蛋白表达量,上调PCNA和Bcl-2蛋白的表达量,且附子理中汤的调节效果较其他2组药物处理更显著。该实验表明四君子汤、理中汤和附子理中汤均能有效促进非酒精性脂肪肝细胞的增殖并抑制其凋亡,且附子理中汤的作用效果最佳,其药效机制可能与3种汤药介导增殖与凋亡相关通路中关键因子的表达有关。