LOXP-DsRed-LOXP系统的构建及其应用

目的构建荷载LOXP-Ds Red-LOXP系统的细胞,并探索该系统在体内外检测Cre酶活性中的应用。方法构建稳转株MCA38^(LOXP-Ds Red-LOXP)并体外验证检测Cre酶效能。将Balb/c裸鼠随机分为两组(n=10),分别在结直肠黏膜下移植MCA38^(Cre-Luciferase)与MCA38^(Luciferase)细胞株,两周后取灌肠液作用于MCA38^(LOXP-Ds Red-LOXP),验证该系统体内检测Cre酶效能。APC^(LOXP/LOXP)小鼠随机分为两组(n=20),分别使用可表达Cre酶及荧光素酶(Luciferase)的慢病毒颗粒(CL组)与仅表达Luciferase的慢病毒颗粒(L组)行小鼠结直肠黏膜下注射,感染后第3天及第3周末取灌肠液检测Cre酶活性及表达情况,同时行小鼠活体成像检测Luciferase表达情况,验证该系统在判断Cre酶活性与预测基因修饰成功率中的应用。结果 Cre重组酶作用于MCA38^(LOXP-Ds Red-LOXP48) h后,红色荧光明显减弱。裸鼠灌肠液作用于MCA38^(LOXP-Ds Red-LOXP)细胞株48 h后,MCA38^(Cre-Luciferase)组红色荧光明显减弱。CL组模型鼠病毒注射后第3天检出16只小鼠荧光素酶及灌肠液Cre酶阳性,第3周末8只小鼠荧光素酶及灌肠液Cre酶阳性。L组模型鼠病毒注射后第3天检出17只小鼠荧光素酶阳性而灌肠液Cre酶均阴性,第3周末检出8只小鼠荧光素酶阳性,灌肠液Cre酶均阴性。结论成功构建Cre酶检出系统MCA38^(LOXP-Ds Red-LOXP),实现了体内、外无创性检测Cre酶活性及表达情况,并以此评价APC^(LOXP/LOXP)小鼠结直肠黏膜基底干细胞病毒感染效率及基因修饰情况。