利用新型DNDF7和携带LoxP位点的LPL4质粒快速构建S-Sox5基因打靶载体

目的体外实验已证实S-SOX5蛋白转录调节运动纤毛基因Spag6，为进一步探索其在体内的作用，拟构建S-Sox5基因的敲除载体。方法利用新型DNDF-7和携带LoxP位点的LPL4载体，选择S-Sox5基因第1外显子作为条件性敲除目的片段，SV129系Es细胞DNA为模板分步扩增包括S-Sox5第1外显子的中间段（middle piece），上游同源左臂4．8kb（upper arm）及下游同源右臂2．5kb（down arm）的基因片段；构建upper-arm-DNDF7、down-arm-DNDF7和middle-piece-LPL4质粒，将middle-piece-LPL4的酶切产物LoxP—middle—piece．LoxP和down-arm-DNDF7酶切产物相连，形成携带LoxP位点的middle-down-arms-DNDF7重组质粒，该质粒与upper-arm-DNDF7酶切产物相连，获得S-Sox5基因打靶载体。结果经酶切鉴定及测序证实，构建的upper-arm-DNDF7、middle-piece-LPL4、down-arm-DNDF7重组质粒和S-Sox5基因打靶载体结构正确，与设计相符。结论成功构建小鼠S-Sox5条件基因打靶载体，为进一步建立S-Sox5条件敲除小鼠，在体内研究其功能打下基础。