大肠杆菌不耐热性肠毒素LT_B基因的克隆及其核苷酸序列分析

用内切酶ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切大肠杆菌质粒ｐＥＷＤ２９９，回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段，再将载体ｐＵＣ１８用ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，最后将ｐＵＣ１８ＤＮＡ与５０５ｂｐ的ＬＴＢＤＮＡ进行连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＳａｃⅠ／ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１。再将ｐＸＬＴ１进行ＥｃｏＲⅠ酶切、大肠杆菌聚合酶ⅠＫｌｅｎｏｗ大片段补平、ＨｉｎｄⅢ酶切处理，然后与用ＨｉｃⅡ和ＨｉｎｄⅢ酶切的ｐＵＣ１８连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＸｂａⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１－１。将质粒ｐＸＬＴ１－１进行核苷酸序列分析。

利用重组PCR技术构建大肠杆菌肠毒素LT_B0ST_I融合基因

利用重组PCR技术将从原始菌种中扩增得到的LTB、STI 基因片段连接起来 ,构建了LTB STI 融合基因。并将其克隆到 pUCm T载体上 ,转化到大肠杆菌DH5α中 ,得到克隆T LS ,序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框 ,具有起始密码子ATG和终止密码子TAA 。

分别含K88,K99和LT-B亚单位抗原基因的重组痘苗病毒的构建

本文构建了分别含K88,K99和LT-B亚单位抗原基因的重组痘苗病毒,并观察了这3种基因的表达情况。首先将K88亚单位基因克隆入痘苗转移或体PGJP-5中,得到嵌合质粒P_5-K88,将K99和LT-B亚单位基因分别克隆至痘苗转移载体PJ16中,得到重组质粒PJK-9和PLT-B。再经细胞体内同源重组技术,将以上3种基因分别插入到痘苗病毒天坛株的TK基因中,经5-BUdR的选择压力在人TK^--143细胞中挑选TK^-表型病毒,分别以相应的^(32)P标记的基因片段为探针进行杂交筛选重组病毒株。我们得到7株含K99亚单位基因的重组病毒V-K99(Ⅰ～Ⅷ),5株含K88亚单位基因的重组病毒V-K88(Ⅰ～Ⅴ);1株含LT-B亚单位基因的重组病毒V-LTB,ELISA检测结果表明,在以上3种重组病毒感染的人TK^--143细胞培养液和细胞裂解物中均未测出相应的基因表达产物。以上结果表明这3种基因可能不易在痘苗系统内有效表达。