草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白与大肠杆菌LTB亚基植物融合表达载体的构建

根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)VP6蛋白的全基因序列(AF403394)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的基因序列(M17874),设计并合成特异性引物,从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾细胞(CIK)中提取病毒核酸作为模板,进行RT-PCR扩增,得到约1.3 kb的GCRV VP6基因读码框片段,同时提取大肠杆菌(Escherichia coli)H44815全基因组作为模板,进行PCR扩增得到约370 bp的LTB基因读码框片段。将获得的2个目的片段分别克隆到pCR2.1载体上,经酶切、PCR扩增检测和序列测定确认后,将其克隆到携带绿色荧光蛋白标记的植物表达载体pCAMBIA1302上,成功构建了可将草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)、绿色荧光蛋白(GFP)融合表达的植物载体pCAMBIA 1302-LTB-VP6。本研究旨为草鱼出血病可饲化转基因植物疫苗研制奠定基础。

淋球菌nspA和大肠杆菌ltB融合基因的构建、表达及鉴定

通过基因工程的方法构建奈瑟氏淋球菌表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A,nspA)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin,ltB)融合基因的原核表达载体,对其进行表达与鉴定,为后续融合蛋白LTB-NspA的生物活性分析及其作为淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定基础。用PCR法从标准菌株分别扩增出nspA、ltB基因,用重组PCR法通过接头将ltB与nspA融合,将其插入pEG30a中,转入BL21中表达。经测序、SDS-PAGE和Western blot分析,证实成功构建了ltB-nspA融合基因的原核表达载体,并在BL21中表达。ltB-nspA融合基因的成功表达,为进一步研究其生物活性及淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定了一定基础。

rLTB/rCTB-rOmpL1/1融合基因及其原核表达系统的构建和鉴定

目的 :构建 lt B/ ct B- omp L1/ 1融合基因及其原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫和佐剂活性 ,检测问号钩端螺旋体 (简称钩体 )野生株 omp L 1基因的携带和表达情况及钩体患者血清特异性抗体水平。方法 :采用连接引物 PCR构建 lt B- omp L 1/ 1和 ct B- omp L 1/ 1融合基因 ,常规方法构建其原核表达系统。采用 SDS- PAGE、Westernblot和 GM1- ELISA分别检测目的重组蛋白 r LTB- r Omp L 1/ 1和 r CTB- r Omp L 1/ 1表达量、免疫反应性及与 GM1结合的活性。采用 PCR和 MAT分别检测 97株问号钩体野生株 omp L1基因及其表达情况。采用 ELISA检测 2 2 8例钩体患者血清 omp L1基因产物的抗体。结果 :与报道的相关序列比较 ,lt B- omp L1/ 1和 ct B- omp L1/ 1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性 ,分别为 99.7%～ 99.9%和 99.5 %～ 10 0 %。r LTB- r Omp L1/ 1和 r CTB- r Omp L1/ 1表达产量均约为细菌总蛋白的 10 % ,主要以包涵体形式存在。 r LTB- r Omp L 1/ 1和 r CTB- r Omp L1/ 1均分别能与r Omp L 1/ 1兔抗血清和牛 GM1结合。 89.7%问号钩体野生株含有 omp L1基因 ,87.6 %问号钩体野生株分别与r Omp L 1/ 1和 r Omp L1/ 2兔抗血清出现效价 ,为 1∶ 4～ 1∶ 2 5 6的 MAT阳性结果。 86 .8%和 88.6 %的患?

LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用

分别从幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中扩增1tB和hpaA基因，构建1tB-hpaA融合基因厦其原核表达系统，鉴定其表达产物的免疫原性、佐荆活性及其对Hp SS1株感染小鼠的保护作用．采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增hpaA基因和1tB基因片段，构建1tB-hpaA融合基因，T—A克隆后测定核苷酸序列．采用质粒pOE32和宿主菌E．coliM15构建1tB-hpaA融合基因表达系统，并用不同浓度的IPTG诱导表达．采用western blot和GM1—ELISA鉴定表达产物的抗原性、免疫反应性和佐荆活性．建立HP SS1株感染BALB／e小鼠模型，检测rLTB-HpaA的免疫保护效果．采用ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中HpaA抗体和41株Hp临床菌株HpaA表达情况．与Gen Bank登录的相关序列比较，所构建的ltB-hpaA融合基因核苷酸序列同源性分别为94．25％～99．71％和95．38％～99．19％．所构建的表达系统pQE32-1tB-hpaA—M15的目的重组蛋白（rLTB-HpaA）表达量高达细菌总蛋白的1／3左右．rLTB-HpaA能与Hp全菌抗体发生结合反应，免疫家兔能产生特异性抗体．GM3-ELISA结果显示rLTB-HpaA能与牛GM1结合．rHpaA免瘦小鼠的保护率仅为66．7％，rLTB-HpaA免疫小鼠的保护率可增至83．3％.81．6％患者血清（102／125）HpaA抗体检测结果阳性，所有菌株均含有HpaA．本文成功地构建了ltB-hpaA融合基因高效原核表达系统，所表达的rLTB-HpaA有良好的免疫原性和佐剂活性，并对Hp感染小鼠有较强的免疫保护作用．

CPA-LTB融合基因的构建与表达

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌染色体和pEWD299中分别扩增出α毒素(CPA)基因和LTB基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含CPA-LTB融合基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pCPA-LTB)。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pET-CPA含有CPA-LTB融合基因,其基因序列和阅读框架均正确。经EISA检测和SDS-PAGE分析,重组菌株表达的CPA-LTB融合蛋白能够被α、LT毒素抗体所识别。重组菌株BL21(DE3)(pCPA-LTB)经IPTG诱导后,融合蛋白CPA-LTB的表达量占菌体总蛋白相对含量的12.5%。

产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达

融合保护性抗原的LT类全毒素具有传输抗原载体和免疫佐剂两重功效。利用基因工程技术,构建了带有信号肽的Pr1as-K88ac-STII-LTA 2/UP-LTB融合基因的双价植物表达载体。双价植物表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,并利用农杆菌介导技术叶盘法转化模式植物烟草。转基因烟草经PCR和RT-PCR初步检测,证明外源基因已经整合到受体植物基因组中,同时表明融合基因在转录水平上有表达。转基因烟草的获得,为进一步研制新型的抗腹泻植物口服疫苗奠定了良好的基础。

大肠杆菌肠毒素STI、STII、LTB融合基因植物表*达载体的构建

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用PCR方法分别从pGEM-5Zf(+)-STI、K88ab(LT+,ST+)质粒中扩增到了STI、STII基因,然后通过三引物PCR实现了STI、STII基因的融合,再与LTB基因融合,并置同一阅读框。LTB基因的5′位于STII基因的3′端,并在ST基因和LTB基因之间插入7个氨基酸的连接肽。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中,并通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105。

含有MAR序列的STI-STII-LTB融合基因在苜蓿中的表达

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用三引物PCR法和酶切实现了STI、STII、LTB基因的融合,LTB基因的5′位于STII基因的3′端,三者在同一阅读框。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中GUS基因的位置。同时构建不含MARs序列的重组质粒。重组质粒pBI121-MARs-STI-STII-LTB、pBI121-STI-STII-LTB通过冻融法转化根癌农杆菌,并通过农杆菌介导法转化杂花苜蓿。转基因苜蓿植株经PCR检测、Southern-blotting分析表明,转基因苜蓿植株基因组中可检测到STI-STII-LTB融合基因;提取转基因苜蓿植株总蛋白质,SDS-PAGE结果显示,转基因植株表达了重组抗原蛋白,且含MAR序列的蛋白表达量要高于不含MAR序列的表达量;Western-dotting免疫检测证实转基因植株表达的重组抗原具有免疫原性。

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建lt B- ure B融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T- A克隆法从幽门螺杆菌(H elicobacter pylori,Hp)临床菌株Y0 6和大肠杆菌4 4 85 1株DNA中获得了ure B和lt B全长基因扩增片段及其克隆,并构建了lt B- ure B融合基因及其原核表达系统p ET32 a- lt B- ure B- E.coli BL2 1DE3.在E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、EL ISA以及GM1 -EL ISA分别证实了目的重组蛋白(r L TB- Ure B)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ure B和lt B核苷酸序列同源性分别为96 .88%～97.82 %和99.12 %～99.71% ,氨基酸序列同源性为99.6 5 %～99.82 %和97.5 8%～99.19% . 0 .1～1.0 mm ol/ L 的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白r L TB- Ure B的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35 % .Western blot结果证实r L TB- U re B不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明r L TB- U re B有良好的免疫反应性及抗原性.GM1 - EL ISA结果显示r L TB- Ure B能与牛GM1 结合,表明r L TB- Ure B有佐剂活性.以兔抗r L TB- U re B为一抗,发现所检测的10 9株Hp临床分离菌株均表达Ure B;以r L TB- U re B为包被抗原,发现所检测的12 5例Hp感染者血清中均存在U re B抗体;表明U re B广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示r L TB- Ure B确有自然表达U re B的抗原特异性.本文成功地构建了L TB- Ure B融合基因原核高效表达系统,所表达的L TB- U re B融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.

ltB-TpN47融合基因原核表达系统的构建

目的分别从梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)临床菌株和大肠杆菌DNA中扩增ltB和TpN47基因,构建ltB-TpN47融合基因及其原核表达系统。方法采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增TpN47基因和ltB基因片段、构建ltB-TpN47融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。采用质粒pET32和宿主菌E.coliBL21DE3构建ltB-TpN47融合基因原核表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达。结果所构建的ltB-TpN47融合基因核苷酸序列与从GeneBank中查询并处理得出的数据基本一致。所构建的表达系统pET32-ltB-TpN47的目的重组蛋白(rltB-TpN47)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右。结论本文成功地构建了ltB-TpN47融合基因高效原核表达系统。

大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定

目的 :克隆大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位 (L TB)及霍乱弧菌肠毒素 B亚单位 (CTB)基因 ,构建其表达载体。方法 :采用高保真 PCR分别从 E.coli4 4 815株与 V.cholerae东 74株基因组 DNA中扩增 L TB与 CTB基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列。分别构建 p ET32 a的 LTB及 CTB表达载体 ,在 E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达。采用 SDS- PAGE及 GM1- EL ISA鉴定表达产物。结果 :所克隆的 LTB和 CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 98.5 4 %～ 99.4 2 % ,氨基酸序列同源性分别高达 97.5 8%～99.19%和 96.77%～ 99.19%。p ET32 a- L TB- BL2 1DE3和 p ET32 a- CTB- BL2 1DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的 30 %和 10 %左右。GM1- EL ISA结果证实 LTB及 CTB融合蛋白均能与牛 GM1结合。结论 :本研究成功地构建了 LTB与 CTB表达系统 ,所表达的 L TB与 CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。

牛轮状病毒VP4基因与LTB基因的融合表达及免疫原性研究

PCR扩增轮状病毒VP4基因和大肠杆菌LTB基因编码区,将其克隆至pET32a载体上,构建pET32a-VP4-LTB质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),PCR、酶切鉴定后进一步测序,测序结果表明融合基因片段由2637 bp组成,为编码879个氨基酸残基的多肽。经IPTG诱导和SDS-PAGE检测发现表达产物分子量约为118.9 KD,以包涵体的形式存在。融合蛋白经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化后免疫小鼠,结果所产生的抗体效价高于单独VP4蛋白的免疫结果但差异不显著(P>0.5),但与对照组相比差异显著。表明所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性,为研制牛轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。

大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白多价卵黄抗体的制备

对已构建的重组菌株BL21(DE3)(pETXKSL3)进行鉴定,酶切鉴定证实重组质粒pETXKSL3含有K88ac-ST1-LTB融合基因且阅读框架正确.Western blot分析表明K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗、K88ac和LTB抗体识别.以K88ac-ST1-LTB融合蛋白为抗原免疫蛋鸡制备卵黄抗体,ELISA法测定卵黄抗体效价可达1∶13 200.仔猪攻毒实验表明制备的卵黄抗体对仔猪黄痢和仔猪白痢的预防有效率为96%,上述研究结果说明K88ac-ST1-LTB多价卵黄抗体对由ETEC引起的新生仔猪腹泻具有很好的预防效果,从而为最终开发出一种新型高效、可替代抗生素的防治新生仔猪大肠杆菌性腹泻的特异性卵黄抗体生物防治制剂打下坚实基础.

猪大肠杆菌热敏肠毒素B亚基基因的克隆及高效表达

本文以多聚酶链反应扩增得到的ＬＴＢ基因ＤＮＡ片段为探针，克隆了含猪源大肠杆菌ＬＴＢ基因的７７５ｂｐＨｉｎｄⅢ酶切片段，对插入片段进行了核苷酸序列测定：将含ＬＴＢ基因的ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ酶切片段插入表达载体ｐＫＫ２２３－３中得到亚克隆ｐＲＸ－ＬＴＢ，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ分析，ｐＲＸ－ＬＴＢ转入大肠杆菌ＪＭ１０７细胞中，在ＩＰＴＧ诱导下，ＬＴＢ基因得到高效表达，其表达量为亲本菌株的３２倍。

河北省仔猪黄白痢流行病学调查及致病菌的分离与鉴定

仔猪黄白痢是危害养猪业的一种常见疾病.通过对河北省不同地区17家猪场的走访调查,探讨仔猪黄白痢大规模爆发的原因和防治对策,并从某猪场发病仔猪的排泄物中分离得到1株菌,经形态学、生物化学和分子生物学实验鉴定,该分离株为革兰氏阴性菌,克氏三糖铁培养产酸产气,LTB与M17873核苷酸序列同源性为100%,该菌株确定为产肠毒素型大肠杆菌.

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因改建及其表达产物粘膜免疫佐剂活性的研究(英文)

目的改建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因序列以提高重组LTB(rLTB)原核表达量,确定重组改建LTB(rrLTB)粘膜免疫佐剂活性。方法按大肠杆菌偏爱密码子合成全长LTB基因的核苷酸序列。构建pET32a-rLTB原核重组表达质粒及pET32a-rLTB-E.coliBL21DE3表达系统,提取重组质粒并测定其插入的rLTB基因序列。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶成像分析系统鉴定rrLTB表达产量,并与未改建的重组LTB(roLTB)比较。采用GM1-ELISA确定rrLTB和roLTB结合牛GM1的能力。分别以幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位(rUreB),检测rrLTB和roLTB对rUreB对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠保护作用及产生特异性S-IgA的增强效应。结果pET32a-rLTB-E.coliBL21DE3经1 mmol/LIPTG诱导后,rrLTB表达量约占细菌总蛋白的35.4%,为roLTB(2.8%)的12.6倍。GM1-ELISA结果证实rrLTB和roLTB均能与牛GM1结合。单一rUreB对感染小鼠的免疫保护率为66.7%,但与rrLTB或roLTB合用时,保护率可至91.6%,并可提高感染小鼠特异性S-IgA产生量(P<0.01)。结论改建的LTB基因能明显提高表达量,所表达的rrLTB仍保持较强的粘膜免疫佐剂活性。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。

大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及生物学活性分析

从大肠杆菌K88(LT+,ST+)菌株中扩增热敏肠毒素B亚基基因(ltb),得到454 bp片段,克隆至pMD18-T载体后,与pET32a(+)定向连接,并转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG 30℃诱导表达重组LTB蛋白。SDS-PAGE显示,重组蛋白分子量约为34 kDa,超声波裂解后,表达产物主要以包涵体形式存在。经鉴定,纯化复性后的LTB蛋白保留部分与GM1结合的生物学活性。

问号钩端螺旋体rLTB/rCTB-LipL32/1免疫保护作用及野生株LipL32基因表达和患者抗体检测

目的 构建LTB- LipL32/ 1和CTB- LipL32 / 1融合基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫和佐剂活性及保护作用,了解问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株LipL32基因携带、表达及钩体病人血清LipL32基因产物抗体产生频率。方法 采用常规分子生物学技术构建LTB- LipL32 / 1和CTB- LipL32 /1融合基因及其原核表达系统。采用SDS PAGE检测目的重组蛋白rLTB -LipL32 / 1及rCTB -LipL32 / 1表达情况。分别采用Westernblot和GM1 -ELISA检测rLTB -LipL32 / 1及rCTB -LipL32 /1的免疫反应性和佐剂活性。采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株LipL32基因及其表达情况。采用ELISA检测2 2 8例钩体病人血清LipL32基因产物的抗体。采用豚鼠保护试验检测重组蛋白的免疫保护作用。结果 与报道的相关序列比较,LTB -LipL32 /1和CTB- LipL32 / 1融合基因核苷酸序列相似性分别为99.12 %～99.71%和98.5 4 %～99.4 2 % ,氨基酸序列相似性分别为97.5 8%～99.6 3%和96 .77%～99.6 3%。rLTB- LipL32 1和rCTB- LipL32 /1表达产量均约为细菌总蛋白的10 % ,并主要以包涵体形式存在。rLTB -LipL32 / 1和rCTB- LipL32 /1均分别能与LipL32 /1兔抗血清和牛GM1结合。97.9%(95 97)问号钩体野生株含有LipL32基因,95 .9% (93 97)问?

大肠杆菌重组LTKA63突变体和LTB黏膜免疫佐剂活性的研究

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)突变体 LTKA63及B亚单位(heat-labile entemtoxin subunit B,LTB)基因原核表达系统,确定rLTKA63和rLTB黏膜免疫佐剂活性。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA和LTB基因,采用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序。构建LTKA63和LTB原核表达载体,采用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径,以GM1-ELISA检测rLTB结合牛GM1的能力。建立幽门螺杆菌SS1株小鼠感染模型,分别以幽门螺杆菌(Hp)重组尿素酶B亚单位(rUreB)和黏附素(rHpaA)为抗原,分别检测rLTKA63和rLTB对rUreB和rHpaA的免疫保护增强作用。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA和LTB基因条带。LTA基因定位突变后获得序列正确的LTKA63突变体。rLTKA63和rLTB表达量分别占细菌总蛋白的30％和20％左右。LTKA63作用后T_H1 和T_H2细胞较阴性对照组分别增加19．9％和42．3％,GM1-ELISA结果证实rLTB能与牛GM1结合。 33．3％(4／12)rUreB和41．7％(5／12)rHpaA免疫小鼠胃黏膜标本中分离出幽门螺杆菌,且rUreB和rHpaA特异性S-IgA检测结果均为阴性。rUreB或rHpaA加用rLTKA63或rLTB免疫后,小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌分离阳性率下降为16．7％～25．0％(P>0．05),rUreB和rHpaA特异性S-Iga阳性率可达41．6％- 58．3％(P<0．01)。结论成功地构建了LTKA63和LTB原核表达系统,所表达的rLTKA63和rLTB均具有较强的黏膜免疫佐剂活性。