基于代谢组学研究肝复乐胶囊抑制LX-2细胞激活机制

目的 研究肝复乐胶囊对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肝星状细胞LX-2激活的影响。方法 LX-2细胞分为对照组、模型组和肝复乐125、250、500μg/mL组。除对照组外,其余各组LX-2细胞给予5 ng/mL TGF-β1刺激24 h建立肝纤维化模型。通过分子生物学手段(RT-qPCR及Western blot等)检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(COL1A1)表达。结合GC-MS法和代谢组学技术检测各组细胞代谢变化,寻找与肝星状细胞激活相关差异代谢物,进行通路富集,预测可能代谢通路。结果 与模型组比较,肝复乐各剂量组LX-2细胞α-SMA、COL1A1的mRNA及蛋白表达降低(P<0.01),并呈剂量依赖性。代谢组学分析显示,丙酸、丁酸、苯丙氨酸、L-苏氨酸、肌醇、D-半乳糖、甘油、油酸、D-甘油酯与肝星状细胞激活关系密切,且在给药后回调,并富集得到4条代谢途径。结论 肝复乐胶囊能够剂量依赖性地抑制TGF-β1对LX-2细胞的激活,并缓解其代谢异常,其机制可能是通过调节半乳糖代谢,甘油酯代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,苯丙氨酸代谢等途径实现的。

木犀草素、欧当归内酯A和黄芪皂苷Ⅰ单用及联用对人肝星状细胞株LX-2增殖、活化的影响

目的 探讨木犀草素(Lut)、欧当归内酯A(Lev)和黄芪皂苷Ⅰ(Ast)单用及联用对人肝星状细胞株LX-2增殖、活化的影响。方法 取对数生长期的LX-2细胞,采用噻唑蓝(MTT)法考察Lut、Lev和Ast对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的LX-2细胞增殖的影响、联用比例确定及Lut、Lev和Ast联用对TGF-β1诱导LX-2细胞增殖的影响;应用CalcuSyn软件计算Lut、Lev及Ast联用抑制LX-2细胞增殖的联合指数(CI),分析3者联用类型;通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测3者对LX-2细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和TGF-β1蛋白表达的影响。结果 MTT结果显示,Lut、Lev和Ast联用摩尔比为1∶1∶10,3者单用及联用对TGF-β1诱导的LX-2细胞增殖均具有抑制作用(P<0.05),并呈浓度依赖性;CalcuSyn软件分析结果显示,3者联用对LX-2细胞的增殖抑制率>15%时CI<1,说明3者联用具有协同增效的作用;Western blot结果显示,Lut、Lev及Ast联用能够显著降低TGF-β1诱导的LX-2细胞中α-SMA蛋白的表达(P<0.01),降低LX-2细胞中TGF-β1蛋白的表达(P<0.05)。结论 Lut、Lev和Ast单用及联用均能抑制LX-2细胞的增殖、活化,3者联用作用更强、具有协同增效的作用,该作用可能与下调肝星状细胞TGF-β1蛋白表达有关。

TGF-β潜态相关肽及其截短体抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞纤维化研究

目的转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)潜态相关肽(latent assotiated peptide,LAP)及其截短体抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞纤维化研究。方法LAP全长命名为LAP-F,LAP截短体命名为LAP-B。用TGF-β1对LX-2处理进行纤维化模型的建立。分组后分别加入LAP-F和LAP-B多肽。control组:在正常情况下进行培养;TGF-β组:加入终浓度10 ng/mL的TGF-β1;TGF-β+LAP-F组:造模后加入终浓度60μg/mL的LAP-F;TGF-β+LAP-B组:造模后加入终浓度60μg/mL的LAP-B多肽。通过Western blot进行纤维化指标FN和α-SMA的蛋白水平检测。细胞免疫荧光实验检测细胞中FN和α-SMA的蛋白水平。结果Western blot结果显示,与control组细胞相比,TGF-β组细胞中纤维化相关蛋白FN的蛋白表达水平明显升高(P<0.001),纤维化相关蛋白α-SMA的蛋白表达也明显升高(P<0.01)。与TGF-β组相比,TGF-β+LAP-B组细胞中FN的蛋白表达明显降低(P<0.01),α-SMA的蛋白表达也明显降低(P<0.01)。与TGF-β组相比,TGF-β+LAP-F组细胞中FN的蛋白表达水平明显降低(P<0.01),α-SMA的蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。与TGF-β组相比,TGF-β+LAP-F组细胞中FN和α-SMA蛋白荧光强度更低。免疫荧光的结果显示与control组细胞相比,TGF-β组细胞中FN和α-SMA的蛋白荧光强度更高,这意味着纤维化相关蛋白表达增多。与TGF-β组相比,TGF-β+LAP-B组细胞中FN和α-SMA蛋白荧光强度更低。与TGF-β组相比,TGF-β+LAP-F组细胞中FN和α-SMA蛋白荧光强度更低。结论LAP-F和LAP-B两种多肽都具有抗LX-2细胞纤维化能力,为后续研究提供基础。

AKT3逆转miR-22-3p/29a-3p对LX-2细胞活化的协同抑制作用

目的探讨丝氨酸/苏氨酸激酶3(AKT3)能否逆转miR-22-3p/29a-3p对人肝星状细胞LX-2活化的协同抑制作用。方法利用TargetScan、Starbase、miRDB和DIANA预测miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因,对筛选出的靶基因进行KEGG、GO和蛋白-蛋白互作(PPI)分析;RNAhybrid分析候选靶基因与两个miRNAs结合的自由能,并通过双萤光素酶报告实验确定它们的靶向关系;采用CCK-8、Transwell和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测LX-2细胞增殖、迁移以及纤维化标志物的表达。结果miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因有24个,且它们富集在与肝纤维化相关的信号通路和生物学过程;候选靶基因AKT3与miR-22-3p和miR-29a-3p的结合自由能分析结合双萤光素酶实验结果提示AKT3是miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因;miR-22-3p和miR-29a-3p mimics能够单独或协同抑制LX-2细胞的增殖、迁移以及纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原α1链(COL1A1)mRNA的表达(P<0.05),AKT3过表达后能够逆转miR-22-3p和miR-29a-3p mimics对LX-2细胞的上述协同抑制作用(P<0.05)。结论AKT3过表达可逆转miR-22-3p和miR-29a-3p对LX-2细胞活化的协同抑制作用。

黄芪多糖和黄芪总甙调控LX-2细胞因子分泌

目的:用黄芪多糖和黄芪总甙对LX-2细胞分泌的与纤维化相关的主要细胞因子进行研究,以探讨黄芪抗纤维化的确切分子机制。方法:不同浓度的黄芪多糖和黄芪甙作用于LX-2细胞,以Real Time Cell Electronics Sensing技术实时检测细胞增殖状态;分别再以25μg/ml和300μg/ml的黄芪多糖和黄芪总甙作用LX-2细胞24 h,提取细胞mRNA,以荧光定量PCR测定转化生长因子1(TGF-β1)、肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)及基质金属蛋白酶9(MMP9)mRNA的变化。结果:300μg/ml的黄芪多糖可抑制LX-2的增殖(P<0.05,94.7 h),但不同浓度的黄芪总甙对LX-2细胞均有促进增殖的作用(P<0.05);25μg/ml的黄芪多糖和黄芪总甙在TGF-β1促进分泌的同时,也上调其它抗纤维化因子,其中黄芪多糖对MMP2的上调(104.9倍)、黄芪总甙对IL-10的上调(550.65倍)最为显著;300μg/ml的黄芪多糖可抑制TGF-β1及HGF、MMP9、IL-10的表达,但仍然上调MMP2的表达,300μg/ml的黄芪总甙也可抑制TGF-β1的表达,但对抗纤维化因子MMP2、MMP9及IL-10仍有明显的上调作用。结论:低浓度(25μg/ml)和高浓度(300μg/ml)的黄芪多糖和黄芪总甙可通过不同的分子机制调控肝星状细胞因子的分泌而发挥抗纤维化作用;黄芪多糖主要以促进MMP2分泌为主,而黄芪总甙则主要通过上调MMP2、MMP9及IL-10的分泌而发挥作用。高剂量的黄芪多糖和总甙抗纤维化效果优于低剂量组。

姜黄素对人肝星状细胞株LX-2瘦素和脂联素表达的影响

目的观察姜黄素对人肝星状细胞株LX-2瘦素和脂联素表达的影响,探讨瘦素和脂联素在姜黄素抗肝纤维化中的作用。方法体外培养人肝星状细胞株LX-2,分别给予0、10、20、30、40、50、60、70、80μmol/L的姜黄素处理,MTT法检测细胞增殖并绘制增殖曲线;根据增殖检测结果,选取30、40、50μmol/L姜黄素分别作用于LX-2,免疫细胞化学染色方法分别检测细胞中瘦素、脂联素的表达,计算阳性表达率。结果 10、20μmol/L姜黄素作用下LX-2增殖与0μmol/L姜黄素比较差异无统计学意义(P>0.05);在30～80μmol/L浓度范围内,LX-2增殖明显降低(P<0.05)。正常LX-2的瘦素和脂联素表达率分别为(90.40±8.37)%和(29.88±3.79)%,30～50μmol/L姜黄素处理24 h后,瘦素表达减少,依次为(78.83±6.81)%、(52.60±4.67)%和(34.02±4.50)%,而脂联素表达升高,依次为(48.69±8.34)%、(73.86±5.73)%和(83.22±3.92)%,与正常LX-2细胞比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论姜黄素可通过抑制肝星状细胞中瘦素表达,诱导脂联素表达而发挥抑制细胞增殖、抗肝纤维化作用。

益气活血方对肝星状细胞LX-2增殖和凋亡的影响

目的探讨中药"复方益气活血方"(Yiqihuoxue prescription)对肝星状细胞LX-2增殖和凋亡的影响。方法体外培养肝星状细胞LX-2,浓度分别为1.125,2.228,3.31,4.37,5.41 mg/ml益气活血方作用于LX-2细胞24 h,48 h,然后用MTT比色法检测细胞的增殖情况,选取合适的益气活血药物浓度(1.125,2.228,6.432 mg/ml)用流式细胞术检测益气活血药作用24 h后对LX-2细胞凋亡的影响。结果 1MTT检测结果显示,不同浓度的益气活血方用于LX-2细胞24 h和48 h后,能够抑制LX-2细胞增殖(P<0.05),24 h抑制率随药物浓度的增加而提高。48 h时,当药物浓度达到3.31 mg/ml后,其抑制作用不随药物浓度的增加而增强(P>0.05)。2流式细胞术检测显示,益气活血方(浓度分别为1.125,2.228,6.432 mg/ml),可明显促进LX-2细胞凋亡。结论益气活血方能抑制LX-2细胞的增殖,促进LX-2细胞凋亡,其抑制作用呈时间-剂量依赖性。

橘皮素的提取分离、改性及对人体肝星状细胞LX-2的抑制作用

通过分离纯化及改性得到橘皮素和5-去甲氧基橘皮素,并研究其对人体肝星状细胞株LX-2的抑制作用。通过无水乙醇提取、氯仿萃取从陈皮中得到多甲基黄酮混合物,再以不同浓度的乙酸乙酯和石油醚的混合液为洗脱剂,采用硅胶柱层析分离纯化多甲基黄酮混合物,得到橘皮素纯品。将橘皮素置于盐酸乙醇溶液中回流,对所得产物进行纯化即可得5-去甲氧基橘皮素,采用质谱和核磁共振谱进行结构确证。利用人体肝星状细胞株LX-2细胞作为工具细胞,研究其生物活性。结果表明,5-去甲氧基橘皮素在12.5μmol/L条件下对人肝星状细胞株LX-2的抑制率即可达到50%,而橘皮素需要在近150μmol/L条件下才能达到50%的抑制率,即改性后的橘皮素对人体肝细胞的抑制有效率增加了10倍以上。

护肝布祖热对CCl4诱导人肝星状细胞LX-2活化的作用及机制研究

目的探讨护肝布祖热(HGBZR)抗肝损伤的作用及机制。方法体外培养人肝星状细胞LX-2,采用MTT法检测LX-2细胞存活率以确定四氯化碳(CCl)造模浓度和药物干预浓度。细胞实验分为6组:空白组、模型组、阳性组(水飞蓟素,10μg·mL)及HGBZR低、中、高剂量组(5、10、20μg·mL),除空白组以外,其余各组分别加入终浓度5 mmol·L^(-1)CCl损伤干预24 h,然后再进行药物干预24 h。采用MTT法检测各组细胞存活率;Annexin V/PE双染法检测细胞凋亡率;qRT-PCR法检测各组细胞α-平滑肌动蛋白(SMA)、TIMP-1、PTP1B、转化生长因子(TGF)-β、Smad3、Smad4、Smad7、CHOP、PERK、IRE1、ATF6 mRNA表达情况;Western Blot法检测各组细胞Jak1、Stat3、TGF-β、Smad3、Smad4、Smad7、CHOP、Caspase12、核因子(NF)-κB p65蛋白表达情况。结果随着CCl浓度(5~30 mmol·L^(-1))升高,LX-2细胞存活率逐渐下降,当CCl浓度为5 mmol·L^(-1)时细胞呈现增殖状态,故选择5 mmol·L^(-1)CCl处理24 h作为肝损伤模型复制条件。与模型组比较,HGBZR中、高剂量组的细胞存活率明显降低(P<0.05),细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明显升高(P<0.05);LX-2细胞的α-SMA、TIMP-1、TGF-β、Smad3、Smad4、CHOP、PERK、IRE1、ATF6 mRNA表达水平明显降低(P<0.05),PTP1B、Smad7 mRNA表达水平明显升高(P<0.05);LX-2细胞的Jak1、Stat3、TGF-β、Smad4、CHOP、Caspase12及NF-κB p65(核蛋白)蛋白表达水平明显降低(P<0.05),Smad7、NF-κB p65(质蛋白)蛋白表达水平明显升高(P<0.05),Smad3蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。结论HGBZR可能通过调控TGF-β/Smad、Jak/Stat和内质网应激信号通路相关目标基因转录水平及蛋白表达,促进活化LX-2细胞的凋亡,对CCl诱导的化学性肝损伤具有一定保护作用。

IL-32γ对LX-2细胞表达Ⅰ型胶原的影响

目的研究IL-32γ可否诱导肝星状细胞LX-2表达Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)。方法不同浓度的IL-32γ与LX-2共培养,分别收集培养上清液、提取细胞总RNA,real-time PCR检测CollagenⅠmRNA表达水平,ELISA法检测CollagenⅠ蛋白质表达水平。用不同浓度的人重组磷酸化p38α蛋白(recombinant human active p38α蛋白)与LX-2细胞共培养,48 h后收集细胞培养上清液,ELISA法检测CollagenⅠ蛋白质表达水平。再用不同浓度的p38MAPK抑制剂SB203580加入LX-2细胞与IL-32γ共培养的培养液中,分别收集培养上清液,采用ELISA检测CollagenⅠ蛋白质表达水平,同时提取细胞总RNA采用real-time PCR检测CollagenⅠmRNA表达水平。结果 IL-32γ诱导人LX-2细胞表达CollagenⅠ,且其表达水平随IL-32γ浓度的增加而增强;人重组磷酸化p38α蛋白可诱导LX-2细胞表达CollagenⅠ增高,阻断p38MAPK可降低IL-32γ诱导的CollagenⅠ表达。结论 IL-32γ通过活化p38MAPK通路诱导LX-2细胞表达CollagenⅠ,IL-32γ可能通过诱导肝星状细胞表达CollagenⅠ而参与肝纤维化的形成。

IL-10-HGF融合基因对肝星状细胞LX-2增殖的抑制作用

目的探讨人白介素-10(IL-10)与人肝细胞生长因子(HGF)融合基因对肝星状细胞LX-2增殖的抑制作用。方法采用PCR方法,分别构建pcDNA3.1-flag-IL-10、pcDNA3.1-flag-HGF与pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF真核表达载体,瞬时转染肝星状细胞LX-2;利用RT-PCR和Western blot检测LX-2细胞中IL-10、HGF的表达;选用MTT法检测转染24、48和72 h后LX-2细胞的增殖情况。结果成功构建了IL-10-HGF融合基因真核表达载体pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF。与pcDNA3.1-flag-IL-10和pcDNA3.1-flag-HGF组比较,pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF融合组48 h和72 h LX-2细胞数减少(n=3,P<0.05)。结论 IL-10-HGF融合基因可有效抑制肝星状细胞LX-2的增殖。

LX-2与HK-2细胞共培养模型的建立及对其细胞转分化的影响

[目的]建立人肝星状细胞(LX-2)与人肾小管上皮细胞(HK-2)共培养体系的理论模型,研究LX-2对HK-2转分化的影响。[方法]以Transwell小室建立体外LX-2细胞和HK-2细胞间接共培养体系。应用细胞免疫组织化学法检测HK-2细胞平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测各组细胞培养液中转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量;逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR法)检测HK-2细胞TβRⅠm RNA、TβRⅡm RNA、Smad2 m RNA、Smad3 m RNA、Smad7 m RNA的表达。[结果]除了空白组,形态学上其他两组均可看到HK-2细胞胞浆染棕黄色,不同数量细胞由立方铺路石样转变为梭形长条状,细胞肥大;HK-2细胞高表达α-SMA(P<0.01);HK-2细胞上清液中TGF-β1含量明显高于空白组(P<0.01);HK-2细胞TβRⅠ、Smad2、Smad3基因表达明显上调,而TβRⅡ、Smad7基因表达明显下调。[结论]Transwell共培养法可诱导HK-2细胞转分化,其机制可能与TGF-β1/Smad信号通路有关。

Reversine对人肝星状细胞系LX-2凋亡的影响

目的探讨Reversine对人肝星状细胞系LX-2凋亡的影响。方法设对照组和Reversine干预组,其中Reversine干预组分为7个浓度,分别为1,5,10,20,40,80,120μg/m L,CCK-8法检测Reversine对LX-2增殖的影响,选取最佳浓度。将细胞重悬在加入5μL FITC-Annexin V和5μL PI,用流式细胞仪进行了凋亡率分析,免疫荧光检测凋亡蛋白bcl-2及caspase 3。结果 Reversine可促进LX-2细胞凋亡,随着Reversine浓度增加,LX-2的凋亡可呈剂量依赖关系,其中10μg/m L为最佳浓度,LX-2细胞的bcl-2蛋白的表达显著下降而cleaved-caspase 3的表达显著上升。结论 Reversine可通过促进caspase-3蛋白活化、抑制bcl-2蛋白表达的方式诱导LX-2凋亡。

委陵菜酸通过阻断核因子κB(NF-κB)信号通路抑制LX-2人肝星状细胞增殖并促进其凋亡

目的研究委陵菜酸(TA)对核因子κB(NF-κB)信号通路的调控作用,分析其对LX-2人肝星状细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法将培养的LX-2细胞分为正常组、血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)刺激组(20 ng/mL)、1-吡咯烷二硫代羧酸铵盐(PDTC)组(PDGF-BB联合10 mmol/L PDTC)、TA处理组[PDGF-BB分别联合(35、25、15)μmol/LTA]。噻唑蓝(MTT)法检测TA对细胞增殖的影响,试剂盒检测天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和总胆红素(TBIL)的活性;流式细胞术检测细胞凋亡情况。实时定量PCR检测核因子κBp65(NF-κB p65)mRNA水平,Western blot法检测NF-κB p65、磷酸化的NF-κB p65(p-NF-κB p65)、NF-κB p65抑制蛋白α(IκBα)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和转化生长因子β(TGF-β)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)的蛋白表达。结果与模型组相比,TA明显抑制LX-2细胞的活化增殖,降低α-SMA和TGF-β的蛋白表达;同时,TA处理可降低细胞中ASL、ALT和TBIL的水平,减少细胞损伤;TA明显诱导LX-2细胞凋亡,下调Bcl2表达同时上调BAX的表达。TA能明显抑制NF-κB p65 mRNA和蛋白表达,抑制NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化。结论TA通过阻断NF-κB信号通路抑制肝星状细胞增殖,促进细胞凋亡。

LX-2细胞中PPARγ对iNOS的影响及其抗肝纤维化作用

目的研究LX-2细胞中PPARγ和i NOS的动态变化及关系,探讨PPARγ抗肝纤维化机制。方法体外培养LX-2细胞,实验分4组:PPARγ激动剂组;PPARγ拮抗剂组;联合干预组;空白对照组。分别加入干预药物培养48小时,采用MTT法检测细胞增殖率;RT-PCR法测各组PPARγ、i NOS m RNA表达;硝酸还原酶法测NO含量;ELISA法测上清液的Ⅰ型胶原、αSMA的含量。结果 1MTT结果示:激动剂组的LX-2增殖抑制作用明显,与联合干预组、抑制剂组及空白对照组相比,具有显著性差异(aP=0.000,bP=0.007,cP=0.003)。2RT-PCR结果示:激动剂组PPARγm RNA的表达较其他3组明显升高(dP=0.005,eP=0.004,fP=0.008);激动剂组i NOS m RNA的表达较其他3组明显降低(aP=0.001,bP=0.003,cP=0.000);且PPARγ与i NOS m RNA表达呈负相关(相关指数为r=-0.8870,P=0.0080)。3硝酸还原酶结果示:激动剂组NO含量(44.89±13.01)μmol/L明显低于其他3组,具有显著性差异(aP=0.001,bP=0.000,cP=0.003)。4ELISA检测结果示:激动剂组Ⅰ型胶原含量(31.807±1.680)ng/ml、α-SMA的表达量(23.351±2.801)ng/ml与其他3组相比,具有显著性差异(aP=0.007,bP=0.009,cP=0.005,dP=0.004,eP=0.003,fP=0.003)。结论 PPARγ激动剂可以上调PPARγ的表达,抑制LX-2增殖,下调i NOS m RNA表达,减少NO产生,降低Ⅰ型胶原及α-SMA分泌,发挥抗纤维化作用;并发现PPARγ与i NOS m RNA的表达具有负相关关系。

IRF3抑制LPS诱导肝星状细胞LX-2的炎症因子的分泌

目的研究干扰素调节因子3(IRF3)对LPS诱导的肝星状细胞中LX-2中炎症因子IL-6及TNF-α分泌的影响。方法利用脂质体将质粒pc DNA3-IRF3瞬时转染到人肝星状细胞LX-2中过量表达IRF3,qRT-PCR和Western blot法检测转染效率,并检测炎症因子IL-6及TNF-α的表达。结果qRT-PCR和Western blot结果显示用2μg/ml的LPS刺激LX-2细胞12 h后,与正常组比较,IRF3的表达量明显降低,而诱导产生的炎症因子TNF-α及IL-6的表达量则明显上升。而pc DNA3转入LX-2细胞12 h后,与pc DNA3空载体对照组比较,pc DNA3转染组中炎症因子IL-6及TNF-α表达量在LX-2细胞中被显著抑制。结论在肝星状细胞中,IRF3能够抑制LPS诱导的肝星状细胞LX-2中炎症因子IL-6及TNF-α的表达。

苦豆碱对活化的LX-2细胞增殖及凋亡的影响

目的研究苦豆碱对活化的人肝星状细胞LX-2增殖及凋亡的影响。方法CCK-8法检测给药24 h和48 h时苦豆碱对于转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))诱导后的LX-2细胞增殖的影响以及给药24 h时苦豆碱对于人正常肝细胞L-02生长的影响,设置给药质量浓度为20、40、60、80、100μg·mL^(-1),同时设置阴性对照组,流式细胞术检测苦豆碱作用于LX-2细胞24 h后,细胞周期及细胞凋亡的变化,RT-qPCR法和Western blot法测定细胞外基质Ⅰ型胶原蛋白(Collagen-Ⅰ)mRNA及蛋白的表达,实验均设置阴性对照组、TGF-β_(1)组、TGF-β_(1)+苦豆碱(20、60、100μg·mL^(-1))组。结果CCK-8法结果显示,除给药质量浓度为20μg·mL^(-1)的给药组,其余各给药组细胞OD值较TGF-β_(1)诱导组显著降低(P<0.01,P<0.001),并且具有剂量依赖性;苦豆碱在60μg·mL^(-1)内对L-02细胞的生长抑制率均小于20%;流式结果表明,给药组细胞G1期比例显著提高(P<0.001),且除给药质量浓度为20μg·mL^(-1)的给药组,其余给药组细胞凋亡比例显著提升(P<0.001);RT-qPCR及Western blot结果显示,苦豆碱能够明显抑制Collagen-ⅠmRNA和蛋白表达(P<0.001)。结论苦豆碱能够抑制活化的LX-2细胞增殖,促进其周期阻滞及细胞凋亡,并减少Collagen-ⅠmRNA及蛋白的表达,同时对正常肝细胞毒性较小。

人参皂苷Rh2调节TNF/MAPK和NF-κB信号通路抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活化

目的评估人参皂苷Rh2对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的LX-2细胞活化的药理作用,并阐明Rh2抗纤维化的作用机制。方法人肝星状细胞(HSC)细胞系LX-2采用TGF-β1(10 ng·mL^(-1))诱导建立肝纤维化细胞模型,通过CCK-8法检测LX-2细胞的生长曲线和Rh2对细胞的毒性;Western Blot检测LX-2细胞中α-SMA、结蛋白(Desmin)、波形蛋白(Vimentin)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL^(-1)β、一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶2(COX2)、肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、核因子κB(NF-κB)P65、p-P65、p-IκBα、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p-ERK、应激活化蛋白激酶(JNK)、p-JNK、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38、p-p38蛋白表达的相对含量。结果LX-2细胞接种密度为每毫升2.5×104个细胞,接种48 h后进行实验,其中10μg·mL^(-1)和20μg·mL^(-1)的Rh2不影响细胞活力;Rh2能抑制TGF-β1诱导LX-2细胞中α-SMA、Desmin、Vimentin的表达(P<0.01),减少炎症因子TNF-α、IL-6、IL^(-1)β的表达(P<0.05),且能降低iNOS、COX2的表达(P<0.01)以及调节TNF/MAPK和NF-κB信号通路中蛋白的表达(P<0.01)。结论人参皂苷Rh2可以通过调节TNF/MAPK和NF-κB信号通路减轻炎症反应,从而抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞肝纤维化。

人脂联素真核表达质粒构建及其在LX-2中的表达

目的构建人全长脂联素真核表达质粒,转染人肝星状细胞系(LX-2),观察其表达及分泌情况,为脂联素在肝纤维化作用的基础及临床研究提供实验数据。方法提取人脂肪组织mRNA,用RT-PCR扩增出添加酶切位点的人全长脂联素基因片段,双酶切扩增出的目的基因片段及空载体质粒P7,将酶切后的片段进行连接、转化构建质粒。用FuGENE HD将构建成功的质粒转染LX-2细胞,用免疫荧光观察其转染效率及细胞定位,Western blotting检测脂联素蛋白表达。结果酶切及测序证实成功构建人全长脂联素真核表达质粒,免疫荧光检测转染效率约为40%,Western blotting检测到30000处存在目的蛋白表达,与预期相对分子质量一致。结论成功构建的人全长脂联素真核表达质粒能有效转染LX-2细胞及表达脂联素蛋白。

草乌甲素对乙醛诱导的LX-2细胞ECM分泌及相关蛋白表达的影响

目的:探讨草乌甲素(BLA)对乙醛诱导的人LX-2肝星状细胞(LX-2细胞)外基质及其相关蛋白的影响。方法:将细胞分为空白对照组(NC组)、乙醛组(模型组)和BLA+乙醛组(BLA组),乙醛浓度为400μmol/L,BLA浓度为18.75μg/mL。对NC组和BLA组LX-2细胞进行形态学评价和DAPI染色,ELISA检测三组Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)和Ⅲ型胶原蛋白(Col-Ⅲ)的浓度,WB检测三组α-SMA、TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的蛋白含量。结果:乙醛组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量高于对照组(P<0.05),而BLA组Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量低于乙醛组(P<0.05)。乙醛组TGF-β1、α-SMA和TIMP-1蛋白含量均高于对照组(P<0.05),而MMP-1蛋白含量低于对照组(P<0.05);BLA组TGF-β1、α-SMA和TIMP-1蛋白含量均低于乙醛组(P<0.05),而MMP-1蛋白含量高于乙醛组(P<0.05)。结论:BLA可能通过抑制TGF-β1信号通路来抑制LX-2细胞的激活和增殖,并通过降低MMP-1/TIMP-1比值来降低Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量。