Quantitative investigation of invasive effects of laminin-receptorantibodies on human colorectal carcinoma cell lines

Objective To investigate the relationship between expression of type Ⅳ collagenase (Ⅳ col ) andthe invasion of laminin-receptors (LNR) in human colorectal carcinoma cells. Methods: The expression ofLNR and Ⅳ col in human colorectal carcinoma(HCC) cell lines were detected quantitatively with different potential metastasis. By using human amniotic membrane(HAM) invasion model, we observed the expressionof Ⅳ col and invasion in both HCC cell lines affected by LNR monoclonal antibodies. Results: High metastaticpotential cell line Lovo expressed higher levels of LNR and Ⅳ col than HT29, a low metastatic potential HCCcell line. The number of cells adhered to HAM of Lovo were more than that of HT29. When the cells of thetwo HCC cell lines blocked by LNR antibodies, the expression of Ⅳcol were decreased, and the cells adheredto HAM expressed Ⅳ col were also decreased. Conclusion: LNR might affect the regulation of expression ofⅣ col in tumor cells by cellular signal communication, and then affect the invasion and metastasis of tumor.

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的微量蛋白制备抗血清

目的 以SDS PAGE纯化的微量蛋白制备抗人层粘连蛋白受体前体蛋白 (LRP)的血清。方法 以SDS PAGE分离纯化原核表达的人LRP与 6×组氨酸的融合蛋白 ,切下并粉碎融合蛋白所在凝胶块。将含 10 μg融合蛋白的凝胶颗粒与弗氏佐剂混匀后 ,免疫BALB/c小鼠。以Westernblot检测所获抗血清的滴度和特异性。结果 以胃癌细胞总蛋白为靶抗原时 ,Westernblot显示 ,所获抗血清仅识别 1条Mr 约 4 2 0 0 0的蛋白带 ,将抗血清做 1∶2 0 0 0稀释后 ,仍能清晰地显示其靶抗原所在位置。结论 以聚丙烯酰胺凝胶颗粒为载体 。

MMP-9和层粘连蛋白受体在乳腺癌组织中的表达及其与转移和预后的关系

背景与目的:以往对乳腺癌细胞外基质与肿瘤转移及患者预后之间关系的研究尚少,且结论不一。本研究探讨乳腺癌组织中基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)及层粘连蛋白受体(lamininreceptor,LM-R)表达与肿瘤转移及患者预后的关系。方法:应用免疫组化方法检测80例乳腺癌组织及10例乳腺增生病组织中MMP-9、LM-R的表达,并用计算机图像分析系统测定表达的吸光度值。采用t检验、方差分析及相关分析方法分析它们与肿瘤转移和患者预后的关系。结果:乳腺癌组织中MMP-9表达显著高于乳腺增生病(t=8.87,P<0.05);在乳腺增生病组织中,LM-R表达于基底膜及部分腺泡和导管的腔缘,在乳腺癌组织中表达于细胞质及胞膜;17例癌间质血管基底膜有LM-R表达的癌组织中,LM-R表达高于血管基底膜无LM-R表达组(t=2.02,P<0.05);LM-R表达与组织学分级有关,分化低者,表达水平高(F=3.27,P<0.05);MMP-9及LM-R表达均与淋巴结转移有关,它们在有3个以上淋巴结转移组的表达低于3个以下及无转移组(tMMP-9=3.42,tLM-R=4.31,P<0.05),原发灶与转移灶的表达呈正相关(rMMP-9=0.654,rLM-R=0.755,P<0.001);MMP-9与孕激素受体负相关性(r=-0.363,P<0.05);MMP-9与LM-R之间呈正相关(r=0.503,P<0.01)。

肝癌细胞67kDa层粘连蛋白受体的表达

背景与目的:本实验室最近发现人肝癌细胞SMMC-7721表达的67kDa层粘连蛋白受体(67kDaLamininreceptor,67LR)与层粘连蛋白的结合能力明显高于正常肝细胞L-02表达的67LR,而67LR在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达水平尚不清楚。本研究旨在探讨67LR在肝癌细胞中的表达,及其与层粘连蛋白结合能力的关系。方法:以人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2和正常肝细胞L-02为材料,采用131I标记的层粘连蛋白测定其与细胞的结合能力;采用流式细胞术和RT-PCR分析67LR蛋白和mRNA的表达水平。结果:(1)相同条件下SMMC-7721、HepG2细胞与层粘连蛋白特异结合量分别为(17.54±0.49)ng/105cell、(11.18±0.53)ng/105cell,而L-02细胞的特异结合量为(8.36±0.48)ng/105cell,表明肝癌细胞与层粘连蛋白的结合能力明显高于正常肝细胞(P<0.01);(2)流式细胞术分析,SMMC-7721细胞的67LR阳性表达率为34.7%,L-02细胞的67LR阳性表达率为55.3%,而HepG2细胞则几乎不表达67LR;(3)RT-PCR产物进行半定量分析发现,两株肝癌细胞的67LRmRNA表达水平明显高于L-02细胞。结论:肝癌细胞与层粘连蛋白的结合能力明显高于正常肝细胞L-02,而细胞膜表面的67LR水平却低于L-02细胞,提示SMMC-7721细胞67LR的亲和力可能高于L-02细胞,而且还涉及其它层粘连蛋白受体。

67kD层粘连蛋白受体的克隆、表达及其对肝癌细胞侵袭能力的影响

探讨细胞膜表面 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7kDlamininreceptor ,6 7LR)在肝癌细胞侵袭转移中的作用 ,从肝癌细胞中提取RNA ,通过RT PCR扩增 6 7LR的前体——— 37kD层粘连蛋白受体前体(37kDlamininreceptorprecursor,37LRP)基因并定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1 myc His(- )A ,采用脂质体将重组质粒转染到HepG2肝癌细胞中 ,通过G4 1 8筛选和RT PCR、流式细胞术鉴定 ,获得了细胞膜表面 6 7LR高表达 (阳性率为 6 9.2 % )和低表达 (阳性率为 1 1 .7% )的细胞克隆 ,采用体外细胞侵袭实验测定不同细胞的侵袭能力 ,发现膜表面 6 7LR高表达的细胞侵袭能力明显高于低表达及不表达细胞 ,说明 6

层粘素LN及其受体LN-R在胆管癌淋巴结转移中的作用

目的：探讨人胆管癌细胞中ＬＮ和ＬＮ—Ｒ的表达水平与胆管癌转移的关系。方法：应用 Ｓ—Ｐ免疫组化法 对５２例人胆管癌细胞中ＬＮ和 ＬＮ－Ｒ的表达水平进行研究。结果：ＬＮ及 ＬＮ－Ｒ高表达与胆管癌淋巴结转移至明显 相关， ＬＮ及 ＬＮ—Ｒ阳性肿瘤淋巴结转移率（８３％，５５％）明显高于ＬＮ—Ｒ阴性肿瘤（１５％，２０％，Ｐ＜０．０５），且ＬＮ及 ＬＮ—Ｒ 的表达与胆管癌组织学类型、分化程度亦存在明显相关（Ｐ＜０．０５）。结论：ＬＮ及ＬＮ—Ｒ的表达在胆管癌淋巴结转移中 的关系起联合作用。

层粘连蛋白受体单克隆抗体对人肺癌细胞形态、粘着及铺展的影响

应用体外细胞培养，观察了层粘连蛋白受体单克隆抗体（ＭｃＢ＿１）加入培养液或预处理人肺巨细胞癌（ＰＧ）和肺腺癌（ＰＡａ）后某些生物学行为的改变。在体外ＭｃＢ＿１预孵育可抑制ＰＧ和ＰＡａ在层粘连蛋白基质上的粘着和铺展。培养液中加入ＭｃＢ＿１经扫描电镜观察，ＭｃＢ＿１明显改变该两种细胞的表面形态。说明层粘连蛋白受体在肿瘤浸润和转移中可能起重要作用。层粘连蛋白受体单克隆抗体在阻断肿瘤转移的发生上可能具有应用价值。

恶性纤维组织细胞瘤LN-R与Cath-D的表达及临床意义

目的:研究层粘连蛋白受体(laminin receptor,LN-R)和组织蛋白酶D(Cathepsin D,Cath-D)在恶性纤维组织细胞瘤(malignant fibrous histiocytoma,MFH)组织中的表达情况,探讨它们之间的关系及临床意义。方法:65例MFH组织标本来自1999年4月至2001年12月哈尔滨医科大学附属肿瘤医院骨科手术患者,其中男40例,女25例;年龄23～78岁(平均年龄54岁)。应用免疫组化方法检测65例MFH组织与10例正常纤维组织中LN-R和Cath-D的蛋白表达情况,分析LN-R与Cath-D在MFH中的表达与MFH临床病理学特征之间的关系,以及二者表达的相关性。结果:光学显微镜下LN-R阳性反应物着色部位主要定位于细胞膜和细胞浆,Cath-D阳性反应物主要定位于细胞浆;65例MFH组织中LN-R和Cath-D蛋白表达阳性率分别为66.2%和75.4%;LN-R和Cath-D在Ⅰ～Ⅱ期的阳性表达率低于Ⅲ～Ⅳ期的阳性表达率,二者统计学差异有显著性(P<0.05);LN-R和Cath-D的阳性表达率在高分化明显低于中分化和低分化,表明随着肿瘤病理分化程度的降低,LN-R和Cath-D的阳性表达率也有升高的趋势;10例正常纤维组织中两蛋白均不表达;LN-R和Cath-D的表达与MFH患者的性别、年龄和组织学类型无关;所有病例经过半年至7年随访,平均随访时间为5年,LN-R与Cath-D在术后生存期小于5年的患者中的阳性表达率明显高于生存期大于5年的患者,二者统计学差异有显著性(P<0.005);LN-R和Cath-D表达呈显著正相关(P﹤0.01)。结论:LN-R和Cath-D在MFH发生、发展中起重要作用,是判断MFH侵袭力和恶性进展、转移和预后的重要指标。

胃腺癌组织层粘连蛋白受体表达的意义

目的:探讨LN-R在判断胃腺癌浸润转移及预后中的作用方法:应用免疫组织化学S-P法检测76例胃腺癌组织和10例正常胃组织中LN—R的表达水平,比较LN—R的不同表达率与生存率的关系. 结果:LN—R在胃腺癌组织中阳性表达率为51.3%,较正常组织(10.0%)显著增高(P<0.05),与分化程度、Borrmann分型、浸润深度、肿块大小、淋巴结转移程度比较关系显著(X2=10.606、9.979、6.838、7.611、12.509,P<0.05),LN-R阳性表达者的生存时间较阴性者短(X2=9.980,P<0.05).

层粘连蛋白及其受体在妊娠滋养细胞肿瘤中的表达及意义

目的 了解葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌组织中层粘连蛋白(L N )及其受体(L N - R)的表达,并探讨L N、L N - R与妊娠滋养细胞肿瘤(GTT)侵袭和转移的关系。方法 以4 4例恶性GTT为研究组,2 4例葡萄胎为对照组,采用免疫组化方法对两组患者首次清宫标本组织进行L N,L N- R检测。结果 L N在绒毛膜癌组织中临床分期越晚,表达率越高,其表达与绒毛膜癌细胞的浸润转移以及恶性程度有一定关系。结论 化疗对L N、L N- R在妊娠滋养细胞肿瘤中的表达有一定的影响,推测L N和L N- R在妊娠滋养细胞肿瘤抗侵袭和转移治疗方面具有潜在的应用价值。

胆脂瘤上皮过度增殖行为的免疫组化研究

目的 探讨中耳胆脂瘤上皮的过度增殖性和生长方式。方法 用免疫组化SP法观察了表皮生长因子受体 (epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR) ,增殖细胞核抗原Ki6 7、Ⅳ型胶原蛋白(collagenIV)和层粘连蛋白 (laminin ,LN)在 18例胆脂瘤标本的表达 ,并与 8例外耳道正常皮肤相比较。结果 EGFR有两种染色图案 ,棕黄色的线状或颗粒状胞膜强染色和颗粒状的胞浆染色 ,胆脂瘤标本染色均强于皮肤。在Ki6 7的免疫染色中 ,阳性细胞核为棕黄色 ,胆脂瘤上皮的阳性细胞核比皮肤多。CollagenIV和LN图案极其相似 ,为连续的棕黄色线状和 (或 )带状图案。 4例胆脂瘤上皮基膜下结缔组织中的血管比皮肤丰富。结论 EGFR和Ki6 7在胆脂瘤上皮的表达从不同角度反映了胆脂瘤上皮的过度增殖性。CollagenIV和LN的表达说明胆脂瘤属良性病变 。

胆管癌细胞层粘连蛋白受体表达下调对蛋白水解酶MMP-2、MMP-9 mRNA表达的影响

研究层粘连蛋白受体 (lamininreceptor,LNR)反义寡核苷酸硫代修饰片段 (AS OD)对人胆管癌QBC939细胞MMP 2、MMP 9基因表达的调节。应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法分析 12 μmol/L浓度的LNRAS OD在作用 72h后对QBC939细胞MMP 2、MMP 9mRNA表达水平的影响。结果显示 ,LNRAS OD能明显抑制人胆管癌细胞表达MMP 2、MMP 9的作用 ,与正常对照相比 ,其MMP 2、MMP 9mRNA相对丰度分别下降了 33 2 %和 2 3 9% (P <0 0 5 )。研究表明 ,LNRAS OD是胆管癌细胞表达MMP 2和MMP 9基因的调节剂 ,能抑制胆管癌细胞MMP 2、MMP 9基因的表达。

层粘连蛋白受体Ⅰ与hPeriod1相互作用的研究

目的寻找与节律蛋白hPeriod1(hPer1)相互作用的蛋白,并对筛选出的层粘连蛋白受体Ⅰ(Lamr1)在节律系统中的功能作初步研究。方法分别构建pGAD rec脑/cDNA文库和pGBKT7/hPer1bH LH-PAS重组诱饵蛋白质粒,酵母双杂交筛选下丘脑里与hPer1相互作用的蛋白。利用RT-PCR技术检测新蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织中的表达及在SH-SY5Y细胞中的节律性质。通过RNA干扰技术研究新蛋白与hPer1的关系。结果通过酵母双杂交筛选,证明Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用。该蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织广泛表达,灰度比较显示经马血清诱导后的SH-SY5Y细胞的hPer1表达呈现近日节律,而Lamr1表达无节律变化。RNA干扰显示hPer1表达下调不影响Lamr1的表达。结论Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用,但其表达在RNA水平无节律变化。Lamr1参与细胞的黏附、转移和侵袭。其前体蛋白作为核蛋白参与细胞蛋白的合成。Lamr1可能参与hPer1相关的生物节律系统的信号传出。

乳腺癌组织层粘连蛋白受体表达的预后意义

目的：为了观察层粘连蛋白受体与乳腺癌临床和病理参数之间的关系，以及对患者生存的影响。方法：用免疫组织化学ＬＳＡＢ法检测了１０９例乳腺癌原位灶组织和其中３７例淋巴结转移灶组织中层粘连蛋白受体（ＬＲ）的表达情况。结果：在乳腺癌原发灶中有６０例（５５．０４％）阳性，淋巴结转移灶中有３１例（８３．７８％）阳性，两者表达率之间的差异有显著性意义（Ｐ＜０．０１）。ＬＲ表达与患者年龄、组织分级、肿瘤坏死和核分裂无显著关系。有淋巴结转移者ＬＲ表达率（６３．６３％）高于无淋巴结转移者（４６．２９％）。在３年以上随访材料中，８０％的死亡病例有ＬＲ表达，而生存者中仅有３５．１７％表达ＬＲ，其差异有极其显著性意义（Ｐ＜０．０１）。结论：ＬＲ与癌细胞的浸润和转移潜能关系密切，是推测患者预后差异的生物学参数之一。

大鼠实验性脑室出血后LN及LNR-1在脑内的表达及意义

目的观察大鼠脑室出血后层粘蛋白(LN)及其受体LNR-1在大鼠脑内的表达变化,探讨其与出血后慢性脑积水之间的关系。方法将大鼠随机分为3组:正常对照组、假手术对照组、实验组,将枸橼酸化的0.1 ml自体静脉血注入实验组大鼠侧脑室内建立出血后慢性脑积水模型(假手术组注入0.1 ml生理盐水),采用免疫组化方法观察出血后不同时间LN及LNR-1在脑内的表达变化。结果实验组30 d出现脑积水为80%(4/5)、其余组别未出现慢性脑积水;实验组出血后LN在纵裂池、软脑膜、蛛网膜、硬膜、脑内毛细血管壁、蛛网膜下腔血管壁的表达在3 d时增加,7 d表达继续增加,14 d表达最强,较对照组、假手术组显著增强(P<0.01),30 d仍强烈表达;实验组出血后LNR-1在脉络丛的立方上皮细胞胞浆及顶质膜、室管膜细胞、软脑膜细胞、蛛网膜细胞、硬膜、纵裂池、胶质细胞的表达增加。LNR-1在蛛网膜下腔的表达变化与LN基本一致。结论大鼠脑室出血后LN及LNR-1的表达上调可能参与蛛网膜纤维化的过程,从而在出血后慢性脑积水的形成中发挥重要作用。

SMMC-7721肝癌细胞67kD层粘连蛋白受体的分离纯化

分离纯化肝癌细胞的 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7LR) ,以便进一步研究 6 7LR的结构、功能及其在肝癌浸润、转移过程中的作用 .以SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞为材料 ,采用13 1I标记的层粘连蛋白测定其与细胞的结合能力 ;亲和层析法分离纯化层粘连蛋白受体 ,用SDS PAGE、放射自显影及体外竞争结合实验进行鉴定 .在相同条件下SMMC 772 1肝癌细胞与层粘连蛋白特异结合量为 17 5 4± 0 4 9ng 10 5细胞 ,而L 0 2正常肝细胞与层粘连蛋白的特异结合量为 8 36± 0 4 8ng 10 5细胞 .经过亲和层析 ,从SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞均可获得纯化受体 ,SDS PAGE显示为单一条带 ,分子量为 6 7kD ,放射自显影及体外竞争结合实验表明其具有较强的与层粘连蛋白结合的活性 .体外竞争结合实验表明 ,SMMC 772 1肝癌细胞层粘连蛋白受体 (772 1LnR)的抑制率可达到 96 2 7± 2 2 9% ,而L 0 2正常肝细胞层粘连蛋白受体 (L 0 2LnR)的抑制率为 4 8 71± 3 79% ,这说明 772 1LnR与层粘连蛋白的亲和力明显高于L 0 2LnR(P <0 0 0 1) .结果表明 ,与L 0 2肝细胞比较 ,SMMC 772 1肝癌细胞具有与层粘连蛋白较强结合能力的特异受体 ,并从肝癌细胞膜上分离纯化到与层粘连蛋白有较强亲和力的 6

绝经后女性盆底脏器脱垂患者阴道前壁组织中层粘连蛋白、胶原蛋白及雌激素受体的表达

目的研究绝经后女性盆底脏器脱垂患者阴道前壁组织中层粘连蛋白(LN)、胶原蛋白及雌激素受体(ER)的表达。方法选择2016年1月至2018年12月于上海市嘉定区妇幼保健院因绝经后盆底脏器脱垂行阴式全子宫切除术+阴道壁修补术的40例患者作为观察组;另选择同期因其他子宫良性病变行阴式子宫全切术的40例患者作为对照组。术前采用酶联免疫吸附试验检测2组患者血清LN水平;术中取2组患者阴道前壁组织,采用荧光定量聚合酶链反应法检测LN mRNA表达,采用免疫组织化学法检测LN、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ及ER表达。结果术前,观察组与对照组患者血清LN水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组患者阴道前壁组织中LN mRNA的相对表达量显著低于对照组(P<0.05)。观察组和对照组患者阴道前壁组织中LN阳性表达率分别为12.5%(5/40)、27.5%(11/40),观察组患者阴道前壁组织中LN阳性表达率显著低于对照组(χ2=45.262,P<0.01)。观察组患者阴道前壁组织中胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ及ER表达评分均显著低于对照组(P<0.05)。结论LN、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ及ER在绝经后女性盆底脏器脱垂患者阴道前壁组织中的表达降低,推测绝经后女性盆底脏器脱垂与以上因素有关。

KAI1基因外源性过表达对胆管癌细胞层黏素受体的影响

目的研究KAI1基因外源性过表达对胆管癌细胞层黏素受体(LNR)表达的影响。方法体外培养人胆管癌QBC939细胞,分为两组:转染空载体pIRES2-EGFP对照组和转染重组真核载体pIRES2-EGFP-KAI1实验组。采用脂质体转染法分别将空载体和重组真核载体转染到QBC939细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。通过RT-PCR、Western blotting和细胞免疫组化法,分别检测KAI1、LNR的mRNA及蛋白表达水平。结果实验组的KAI1 mRNA、蛋白表达量(分别为0.49±0.071、.06±0.05)均显著高于对照组(分别为0.22±0.02、0.59±0.02,P<0.01);实验组的LNR mRNA、蛋白表达量(分别为0.38±0.04、0.29±0.03)均显著低于对照组(分别为0.73±0.05、0.68±0.02,P<0.05)。与对照组比较,实验组KAI1蛋白在胞质的着色明显增强、LNR着色减弱。结论体外胆管癌QBC939细胞过表达KAI1可导致LNR mRNA和蛋白表达下调。

层粘连蛋白受体与配体在C6胶质瘤细胞中的表达及意义

目的检测层粘连蛋白受体与配体在C6胶质瘤细胞中的表达水平,探讨两者在胶质瘤细胞侵袭性生长和诱导神经干细胞迁移中的意义。方法从新生3～5 d的SD大鼠大脑皮层中分离和培养星形胶质细胞为对照,同时培养C6胶质瘤细胞。采用半定量RT-PCR方法分析层粘连蛋白受体和配体mRNA在星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中表达的差异。结果星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中均表达层粘连蛋白受体和配体mRNA,而C6胶质瘤细胞呈明显高表达(P<0.05,P<0.01)。结论C6胶质瘤细胞中表达上调的层粘连蛋白受体和配体可能是胶质瘤细胞侵袭性生长和诱导神经干细胞迁移的因素之一。

层粘连蛋白及其受体与子宫内膜癌关系的初探

了解层粘连蛋白 (laminin ,LN)和层粘连蛋白受体 (laminin -re ceptor ,LN -R)在正常子宫内膜、子宫内膜增殖症、子宫内膜癌中的分布规律 ,探讨内源性LN与LN -R表达间的关系。方法 :用LSAB免疫组化法 ,检测 16例正常子宫内膜、12例子宫内膜增殖症、2 7例子宫内膜癌组织中LN和LN -R的表达。结果 :LN在腺上皮基底膜 (EBM)、腺上皮细胞 /腺癌细胞 (EC)、间质细胞 (SC)中均有表达 ,LN -R仅在EC中有表达。 3组内膜组织间EBM表达构成比、EC及SC内LN表达率及EC内LN -R表达率比较差异均有显著性 (P均 <0 0 1)。 3种内膜LN -R与EC及SC内LN表达明显相关 (P <0 0 1,P <0 0 5)。LN、LN -R表达与子宫内膜病理分级、手术病理分期、绝经状态、雌激素受体有关。结论 :LN及LN -R表达与子宫内膜癌发生、预后有关 ;LN和LN -R的表达间存在内源性的相互调节关系。