淡水养殖鱼类中香港海鸥型菌Laribacter hongkongensis的分离和鉴定

首次从广东省淡水养殖鱼类肠道中分离到了引致人类严重腹泻的新现病原菌-香港海鸥型菌,描述了该菌的培养特性、菌落特征和菌体形态,并进行了理化鉴定;初步研究了该菌对抗生素的抗性谱。

香港海鸥型菌(Laribacter hongkongensis)的鉴定方法研究现状

香港海鸥型菌是从香港肝硬化病人体内分离得到的新细菌菌属,被认为是致腹泻病原菌。为给相关的研究提供参考,介绍香港海鸥型菌选择性培养基的筛选,生物学特征检测方法,基因序列分析检测方法中的16srRNA寡核苷酸序列分析定性鉴定核糖分型(ribotyping)与脉冲电场电泳,自动化细菌鉴定系统。

草鱼肠道中香港海鸥型菌的选择性分离与鉴定

从广东省某市池塘采集商品规格(体重2 0～2 5kg)的草鱼(Ctenoharyngodonidellus),利用加有头孢哌酮的麦康凯琼脂培养基,对其肠道中细菌进行选择性分离与鉴定。结果显示,12尾草鱼的肠道中,5尾可分离到具有以下特征的细菌:两端生鞭毛,菌体弯曲似海鸥状,革兰氏染色阴性,过氧化氢酶、氧化酶、尿酶和精氨酸双水解酶阳性,还原硝酸盐,不发酵、氧化或同化葡萄糖、甘露醇等15种常见的糖醇类,细菌形态、生化特性与报道的香港海鸥型菌相似,阳性率为41 7%。但在肌肉中未分离到此菌。进行分离细菌的16SrRNA基因序列分析,与GenBank中登录的4株香港海鸥型菌序列的同源性为99 7%～99 9%。由菌的培养特征、形态特点、理化特性、16SrRNA基因序列分析等多元鉴定的结果表明,从草鱼肠道中选择分离的细菌为香港海鸥型菌。药敏实验结果表明,所分离菌株对奥格门丁和亚胺培南的敏感性与报道的香港海鸥型菌有一定区别。

不同来源株香港海鸥形菌药敏试验结果分析

目的 对分离自社区获得性胃肠炎患者及淡水鱼肠道内的香港海鸥形菌（Laribacter hongkongensis，LH）进行药敏试验，为临床合理使用抗菌药物提供依据。方法 2005年至2006年杭州市第一人民医院肠道门诊从社区获得性胃肠炎患者中分离到4株及2种淡水鱼体内10株LH菌株，计14株，按美国CLSI推荐的纸片扩散法进行药敏试验。结果 药敏结果显示，14株LH菌株对24种常用抗菌药物中的15种药物，分别表现出不同程度的耐药性，耐药率达62．5％；尤其对青霉素、头孢唑啉和头孢哌酮等3种药物，14株LH菌株均为耐药，耐药率为100．0％；其中人体株LHHZ26，对12种药物耐药、1种为中介。LH对3代头孢表现为较高的耐药性，3种头孢药物的耐药率为71．43％～100％；14株LH株对头孢吡肟及头孢哌N／舒巴坦均为敏感。对氨曲南（14．29％）、庆大霉素（7．14％）、复方新诺明（7．14％）的耐药率较低；喹诺酮类、氯霉素、阿米卡星、美罗培南、亚胺培南等药物均敏感。结论 LH菌株对β-内酰胺类药物表现出耐药性，对青霉素类、头孢菌素类药物广泛耐药。建议对LH感染患者喹诺酮类为首选治疗用药。

广东省水产品中香港海鸥型菌的污染调查与耐药性检测

目的初步了解广东省水产品中香港海鸥型菌(Laribacter hongkongensis)污染及分离株的耐药情况。方法采用改良头孢哌酮麦康凯琼脂(CMA)作为分离培养基,以API 20NE鉴定系统鉴定结果作为确认依据;采用K-B法进行药物敏感试验。结果222份水产样本检出15株目标菌,阳性率6.76%。其中14株分离自草鱼肠脏,1株来自鲤鱼肠脏。分离株及香港海鸥型菌模式株HKU1的药敏结果,对β-内酰胺类抗生素如氨苄西林、头孢噻酚、头孢他啶、头孢曲松等均出现耐药株,未见耐庆大霉素和阿米卡星株。结论结果表明香港海鸥型菌在广东省的草鱼污染率最高,为17.3%(14/81),分离株对β-内酰胺类抗生素耐药情况较严重。

耐复方新诺明香港海鸥型菌中Ⅰ类整合子、磺胺类耐药基因(sul1、sul2)的检测

目的了解香港海鸥型菌淡水鱼与蛙来源分离株磺胺类耐药性以及Ⅰ类整合子介导耐药的情况。方法采用K-B纸片扩散法检测香港海鸥菌耐复方新诺明药物菌株,PCR方法扩增耐药菌株sul1、sul2和Ⅰ类整合子基因。结果 128株香港海鸥菌中共有20株耐复方新诺明药物,耐药率15.6%;20株耐药菌株中sul1阳性率90%,sul2阳性率50%,Ⅰ类整合子携带率80%。结论淡水鱼与蛙来源香港海鸥型菌菌耐磺胺的机制可能与Ⅰ类整合子、sul1、sul2基因有关。

香港海鸥形菌检验技术的建立与应用

目的：建立香港海鸥形菌（Laribacter hongkongensis，LH）的社区获得性胃肠炎患者及淡水鱼类标本采样、运输、培养、分离及鉴定方法。方法：于2005年～2006年，采集社区获得性胃肠炎患者及淡水鱼类新鲜粪样，分别接种SS、XLD、CCDA、TCBS、MacConkey琼脂（MA）以及改良头孢哌酮MacConkey琼脂（CMA）等6种培养基，对典型的菌落，进行常规生化试验，凡氧化酶、触酶试验阳性以及三糖铁试验阴性的菌株，采用特异性PCR检测确诊。结果：社区获得性胃肠炎患者的LH检出率为0．53％（4／759）；淡水鱼类草鱼、鲢鱼与鲈鱼的阳性率分别为9．30％、8．33％和5．88％。结论：本文建立的LH表型与基因型诊断技术适合于LH的诊断；当前LH缺乏血清学诊断，发展LH的PCR诊断方法具有现实意义。

香港海鸥形菌多重PCR及嵌合荧光PCR检测方法的建立与应用

目的建立香港海鸥形菌(Laribacer hongkongensis,LH)的多重PCR(multi-PCR)及嵌合荧光法(SYBR Green I)PCR检测方法,并对其在临床及环境微生物方面的应用前景进行评价。方法通过对62株香港海鸥形菌16SRNA基因和16S-23SrRNA基因间隔区(16-23SrRNA intergenic spacer region,ISR)进行PCR扩增和多序列比对,设计两对特异性引物,建立多重PCR体系,用15种细菌性腹泻标准菌株及临床菌株进行PCR特异性和敏感性检验;并在此基础上针对两对引物分别用嵌合荧光PCR法进行浓度梯度检测,以确定最低检测限。结果香港海鸥形菌多重PCR法特异性为100%,最低检出限为5×103 CFU/mL菌液;而嵌合荧光PCR法两对引物的最低检出限均达到5×102 CFU/mL菌液。结论该法的建立为临床及环境微生物学提供了一种快速和灵敏的香港海鸥形菌检测手段。

香港海鸥型菌对喹诺酮耐药性的检测分析

目的:研究香港海鸥型菌对喹诺酮药物的耐药性情况,并评估琼脂稀释法和纸片扩散法对药敏结果的影响。方法:采用琼脂稀释法和纸片扩散法,对不同来源香港海鸥型菌分离株进行4种喹诺酮类抗生素药敏实验,并对两种检测方法所得结果进行比较。结果:136株香港海鸥型菌对4种常见喹诺酮类抗生素敏感率依次为左氧氟沙星>环丙沙星>诺氟沙星>萘啶酮酸。鱼分离株对左氧氟沙星均敏感,对诺氟沙星和环丙沙星的敏感率达到90%以上。蛙分离株对左氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和萘啶酮酸的敏感率分别为62.50%、37.50%、48.21%、19.64%。采用两种方法检测鱼分离株对左氧氟沙星和环丙沙星两种药物的药敏试验结果具有较好的一致性(>95%),对诺氟沙星具有完全一致性(100%)。对于蛙分离株,两种方法的一致性则较差。结论:香港海鸥型菌对喹诺酮类抗生素的耐药率较高,在蛙分离株中尤为明显。两种方法测定喹诺酮耐药性结果有一定差异,建议使用稀释法进行药敏测试。

温度和pH对香港海鸥型菌GRA1株生长的影响

目的研究温度和pH对草鱼肠道中分离的香港海鸥型菌GRA1株生长的影响。方法应用分光光度计测定光密度计算细菌数量，研究香港海鸥型菌GRAI株在不同温度和pH条件下的生长情况。结果香港海鸥型菌GRA1株在〈15℃和〉42℃的条件下不能生长，28℃是该菌比较适宜的生长温度;在pH5．0～9．5范围内可以生长，最适生长pH值范围为5．5～6．0;加热灭活试验表明香港海鸥型菌GRA1株在营养肉汤中65℃15min、90℃5min、100℃1min被灭活，而在用营养肉汤倍比稀释的草鱼糜中65℃20min、90℃8min、100℃6min被灭活。结论试验表明香港海鸥型菌GRA1株为一种嗜温菌．对热和酸的抵抗力均较强。

广州市腹泻病人香港海鸥形菌和产肠毒素性大肠杆菌感染情况调查及耐药性检测

目的初步了解广州市腹泻病人中香港海鸥型菌(LH)和产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)感染情况和分离株的耐药情况。方法2008年9月～2009年10月于广州某医院采集了646例门急诊腹泻患者的新鲜粪便标本,用EC肉汤进行增菌,并分别采用麦康凯平板及头孢哌酮麦康凯平板进行ETEC和LH的分离培养;用生物梅里埃API20NE和API20E进行生化鉴定;用PCR方法进行基因鉴定;K-B纸片扩散法作耐药性检测。结果646例标本中未检出LH,检出38例ETEC,检出率6%。药敏结果显示ETEC对头孢类抗生素的敏感性较高,而对青霉素类,四环素类及磺胺类抗生素耐药率较高。结论广州市LH的人群感染率可能较低;ETEC引起的腹泻较10年前有降低倾向,仍需进一步做多中心调查。食用水产品可能是ETEC感染的主要危险因素之一;治疗ETEC类腹泻建议首选头孢类抗生素。

香港海鸥型菌耐喹诺酮类抗菌药物机制的研究

目的建立香港海鸥型菌生物被膜体外模型,对香港海鸥型菌携带的Ⅰ类整合子相关基因进行分析,探讨香港海鸥型菌耐喹诺酮类抗菌药物的机制。方法吉姆萨染色法形态学角度分析及生结晶紫染色法半定量检测香港海鸥型菌临床分离株生物被膜的形成能力;微量肉汤稀释法测定香港海鸥型菌临床分离株在浮游生长状态与生物被膜状态下对诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星的敏感性;PCR法检测耐喹诺酮类香港海鸥型菌菌株携带的Ⅰ类整合子相关基因。结果吉姆萨染色法定性结果显示,在55株香港海鸥型菌临床分离株中,有36株形成生物被膜,生物被膜形成率为65.4%(36/55);结晶紫染色法半定量检测香港海鸥型菌生物被膜的形成能力,其中8株香港海鸥型菌的吸光度OD560≤0.15,16株香港海鸥型菌的吸光值0.15<OD560≤0.20,7株香港海鸥型菌的OD560>0.20;诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星对香港海鸥型菌的最小生物被膜抑菌浓度均高于相应浮游菌的最小抑菌浓度(P<0.05);55株香港海鸥菌中共有18株耐喹诺酮类药物,耐药率32.7%,且18株香港海鸥型菌菌Ⅰ类整合子均含有耐药基因,该耐药基因在相应菌株中发挥耐药作用。结论香港海鸥型菌耐喹诺酮类基因的形成和耐药基因的播散可能与Ⅰ类整合子有关。

广州市香港海鸥型菌红霉素耐药性与基因分析

目的了解广州地区香港海鸥型菌分离株对红霉素的耐药性及红霉素耐药基因的分布情况。方法从青蛙和草鱼肠道中分离的菌株共122株,使用K-B法对香港海鸥型菌分离株进行红霉素抗生素的耐药性测定,用PCR方法检测红霉素耐药株中红霉素抗性基因ereA,ereB,ermA,ermB,ernC,MefA/E,mphA,SAT4的携带情况,并将检测阳性结果的PCR产物进行测序分析。结果香港海鸥型菌对红霉素耐药率为28.7%,其中蛙源株耐药率为35.1%,鱼源株耐药率为25.9%。对红霉素耐药的35株菌中,蛙源株ereA基因检出率为30.8%,鱼源株没有检出ereA基因。结论广州地区香港海鸥型菌对红霉素的耐药率较高,蛙源株对红霉素的耐药率比鱼源株高,海鸥型菌蛙源株对红霉素产生的耐药性与ereA基因相关。

首次自褐家鼠粪便标本中检出香港海鸥菌

目的了解褐家鼠粪便标本中是否携带香港海鸥菌,并分析其耐药特征及分子分型。方法2015年6月-2016年5月,利用笼捕法于广州市南方医院及其周边居民区捕获褐家鼠,其粪便样本经增菌后接种改良头孢哌酮MacConkey琼脂(CMA)平板培养分离可疑菌株,经生化试验及16SrRNA测序确认。采用K-B法进行药物敏感性测定,并运用多位点序列分型进行分子分型分析。结果共捕获褐家鼠191只,并在2份褐家鼠粪便标本中检出香港海鸥菌,检出率为1.05%。两株菌16SrRNA的测序结果与香港海鸥菌标准株HKU1的一致性达100%。药敏试验显示两株分离株均对头孢菌素类抗生素及利福平耐药。多位点序列分型结果显示两株菌分别为2个新的ST型:ST-163和ST-164。结论褐家鼠粪便中存在香港海鸥菌污染。褐家鼠与人类生活关系密切,可能为人类感染的的另一潜在来源。

广东省香港海鸥菌感染性腹泻1例分析

目的了解广东省获得性胃肠炎患者中是否存在香港海鸥型菌(LH)感染。方法 2009年4月～12月选择江门市各级医院门诊腹泻患者,采集肛拭子标本,培养分离可疑菌株,经革兰染色、生化鉴定、特异性片段PCR扩增和16S rRNA基因序列测定,进行香港海鸥型菌的鉴定。结果在804例腹泻患者标本中,分离并鉴定1株香港海鸥型菌,符合已有报道菌的菌落特点和生化特征,命名为江门株(JM1),16S rRNA目的基因扩增长度为426 bp,基因序列长度为1 360 bp,与香港分离菌株(NR-025167)同源性为99%,确诊为香港海鸥型菌感染病例。结论证实广东省内社区获得性胃肠炎患者中存在香港海鸥型菌的感染。

社区获得性胃肠炎患者中分离出香港海鸥形菌的研究报告

目的了解中国内地社区获得性胃肠炎患者是否存在香港海鸥形菌感染。方法于2005年8月对杭州市第一人民医院肠道门诊就医患者采集粪样,分别接种SS、XLD、CCDA、TCBS、MacConkey琼脂(MA)以及改良头孢哌酮MacConkey琼脂((2MA)等6种平皿,对分离到的可疑细菌进行常规生理生化实验、16S rRNA基因序列测定、透射电镜(TEM)下形态观察及药敏试验。结果编号为242的标本,在CMA平皿上生长出无色、透明的微小菌落。该菌为革兰阴性,氧化酶、过氧化氢酶、尿素酶和精氨酸双脱氢酶阳性,鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶阴性,不发酵葡萄糖。经16S rRNA基因序列测定,菌株242的基因序列长度为1413 bp,采用:Blast软件对测序结果进行同源性分析显示,与文献报道的香港海鸥形菌同源值达100％。TEM下可见菌体两端有多根鞭毛。药敏试验结果显示,该菌对临床常用的21种抗菌药物表现出不同程度的耐药性,其中对青霉素、氨苄西林、头孢哌酮、头孢他啶表现为耐药。结论证实中国内地社区获得性胃肠炎患者粪便中存在香港海鸥形菌。有关该菌引起感染性腹泻疾病的致病地位与流行病学等特征需进一步深入研究。

筛选与确诊试验在检测香港海鸥菌中的建立与应用

目的建立简便、快速、准确、特异的香港海鸥菌实验室诊断技术。方法采集淡水鱼类、胃肠炎腹泻患者新鲜粪样,接种于改良头孢哌酮MacConkey(CMA)培养基,对典型菌落分别进行氧化酶、触酶、三糖铁(TSI)3项筛选试验和常规生化鉴定,凡氧化酶、触酶试验阳性以及三糖铁(TSI)试验阴性的菌株,采用特异性PCR检测确诊;通用引物扩增16SrRNA并与香港海鸥菌HKU1株进行同源性分析。结果在92份淡水鱼样品和211份胃肠炎腹泻患者粪样中,共检出香港海鸥菌11株和1株,阳性率分别为11.96%(11/92)和0.48%(1/211)。筛选与确诊试验和常规生化试验的检测结果一致,符合率为100%(12/12)。分离的香港海鸥菌16SrRNA序列与HKU1株同源性在99.5%～100%之间,仅差1～2个碱基。结论本文建立的筛选与确诊试验适用于香港海鸥菌的诊断。

广东省江门市淡水产品中香港海鸥菌的检测

目的了解广东省江门市淡水产品中香港海鸥菌污染的状况。方法于2010年7—8月共采集江门市3家农贸市场6个不同品种的淡水产品共计161份进行检测,检样接种改良头孢派酮MacConkey琼脂(CMA)平板培养分离可疑菌株,经革兰染色、生化实验、特异性片段PCR扩增进行香港海鸥菌的鉴定,并选取5株进行了16SrRNA基因序列测定和比对分析。结果 161份检样中共检出香港海鸥菌20株,总阳性率为8.05%(20/161),其中香港海鸥菌在草鱼的阳性率为30.1%(19/63),5只虎纹蛙中检出1只阳性。结论江门市淡水产品中存在香港海鸥菌的污染,草鱼和蛙类可能是污染的重要来源,应加强监测和预警。

香港海鸥形菌分型方法建立与病原学分布调查

目的通过对深圳市感染性腹泻患者标本与外环境水产品标本的检测,掌握深圳市香港海鸥形菌病原学特征及分子分型。方法用传统方法和荧光PCR法同时检测香港海鸥形菌,阳性菌株用K-B法做药敏试验和PFGE分子分型。结果在329份淡水鱼中共检出7份阳性标本,579份腹泻病人标本未检出。该菌对临床常用的24种抗生素耐药性检测结果显示,对氨苄西林、头孢他啶、头孢噻吩、头孢噻腭、头孢哌酮、头孢曲松耐药,头孢西丁为中介,其余均为敏感。7株香港海鸥形菌生化反应阳性的,荧光PCR结果均为阳性。PFGE分子分型表明7株菌不具有同源性。结论本文建立一套完整的对该菌的分离鉴定、基因诊断和PFGE分子分型方法;了解深圳地区主要流行菌型,预测深圳地区该菌的流行趋势,为应对食源性疾病突发事件和水产品安全问题做好技术储备。

河北省淡水鱼香港海鸥型菌分布及耐药性研究

目的了解河北省淡水鱼中香港海鸥型菌的分布现状及耐药性。方法含头孢哌酮32μg/ml的血平板进行分离,API20NE和VITEK GNI+进行生化鉴定,药敏试验采用K-B琼脂纸片扩散法。结果 429份鱼类样本中,检出8株香港海鸥型菌,总检出率为1.86%(8/429),其中草鱼的检出率为5.43%(5/92),鲤鱼为0.53%(1/189),鲫鱼为2.08%(2/96),其他淡水鱼未检出(0/52)。药敏结果显示8株香港海鸥型菌对万古霉素、头孢哌酮、克林霉素、甲硝唑耐药,对多粘菌素B、替卡西林/克拉维酸、红霉素、庆大霉素、阿米卡星、四环素、环丙沙星、磺胺、氯霉素敏感。结论河北省淡水鱼存在香港海鸥型菌的污染并显示一定程度的耐药,应加强监测和预警,防止香港海鸥型菌病在河北省的流行和传播。