Analysis of Diagnostic Efficiency of Excretory-Secretory Antigens for <i>Trichinella spiralis</i>and <i>Trichinella nativa</i>in ELISA

The comparative studies of diagnostic efficiency of excretory-secretory antigens of Trichinella spiralis and Trichinella nativa were performed using blood sera of rats from Wistar line experimentally infected with Arctic trichinellae. For animal infection and antigen preparation Trichinella from muscles of wild carnivorous mammals from Arctic regions of Russia were used. When antigen from T. nativa larvae was used to analyze titers of sera of rats experimentally infected with Arctic Trichinella, a significant increase in efficacy ofELISAwas detected. E.g., sera of rats infected with trichinellae from ringed seals retained in ELISA with T. nativa antigen values higher than diagnostic level at titers of 1:6400 - 1:12800, while titer of those same sera when using T. spiralis antigen was no higher than 1:200 - 1:400.

旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的表达与抗原性分析

目的 对旋毛虫新生幼虫p460 0 0抗原基因进行原核表达并检测重组抗原的抗原性。 方法 利用聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,克隆到原核表达载体 pET 2 8a ,构建重组表达质粒 ,经酶切及测序鉴定后转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)分析表达产物。 结果 SDS PAGE结果显示表达产物的分子量约为Mr 480 0 0 ,与理论值相符。ELISA和Westernblotting结果表明 ,重组蛋白可被旋毛虫感染的猪血清和兔抗重组蛋白血清识别 ;兔抗重组蛋白血清可识别旋毛虫新生幼虫抗原Mr 460 0 0蛋白。 结论 成功表达了旋毛虫新生幼虫p460 0 0抗原基因 ,重组抗原具有良好的抗原性。

犬弓首线虫幼虫培养、排泄分泌抗原的制备和分析

本文报道犬弓首线虫幼虫体外培养、排泄分泌抗原(TES抗原)的制备和分析结果。采用自行研制的幼虫分离器分离人工孵化的犬弓首线虫第二期幼虫,用Eagle's基础培养基培养幼虫,并用饱和硫酸铵盐析法从培养液中提取TES抗原均取得满意结果。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示此抗原,可见到7条蛋白质区带。免疫双扩散表明本抗原与本虫感染的免血清(1:32)作用呈阳性反应。免疫电泳显示至少含有四条沉淀线。转移电泳免疫识别显示本抗原含有5～7个血清学抗原成份。

旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的克隆及序列分析

应用旋毛虫感染猪血清 ,对旋毛虫新生幼虫 c DNA文库进行了免疫筛选。对阳性克隆 p BK- CMV- WN10的序列分析结果表明 ,c DNA全长为 135 2 bp,含有 1个 12 18bp的完整的开放阅读框架 (ORF) ,编码的多肽由 4 0 6个氨基酸残基组成 ,其相对分子质量理论推导值为 4 5 90 0 ,等电点为 5 .4 3,N末端的信号肽及糖基化位点 (NCS)表明其可能为分泌性糖蛋白 ,氨基酸序列 19～ 15 6与 15 8～ 2 95为重复区域 ,相似性为 74 % ,C末端有 1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域 ,但旋毛虫 p4 6 0 0 0抗原与其他线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白结构有很大差异 ,可能已经失去半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的功能。 PCR结果显示 ,从旋毛虫新生幼虫、肌幼虫、3日龄成虫和 5日龄成虫 c DNA中均扩增出此基因 。

旋毛虫肌幼虫强反应原性抗原基因的筛选及生物学特性分析

应用感染旋毛虫60 d猪血清为抗体探针,对旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行免疫筛选,获得旋毛虫肌幼虫期强反应原性抗原基因,利用生物学信息网站(NCBI、BLAST等)及其相关软件(DNA star等)对获得的基因进行序列分析。结果表明:筛选约2.5×105个重组噬菌体,获得13个阳性克隆,有6个克隆为同一个基因,编码蛋白与染色体结构维持蛋白(SMC蛋白,structural maintenance of chromosome proteins)同源性为48.1%,在免疫筛选中均有较强的反应信号;有3个克隆为同一个已知基因(AAF63473),编码蛋白与丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine protease inhibitor)同源性为99%,在免疫筛选中反应信号次之;还有2个为同一个基因,与旋毛虫线粒体(Mitochondrion ofTrichinella spiralis)DNA有较高的同源性(同源性为87.7%),编码核糖体大亚基RNA,其他2个为未曾报道过的新基因,编码不同的未知蛋白,这4个克隆在免疫筛选过程中反应信号相对较弱。得到的2个强反应原性的旋毛虫肌幼虫cDNA分子,其中相对信号最强cDNA分子编码SMC蛋白,另一个编码丝氨酸蛋白酶抑制因子,二者有望用于旋毛虫病的诊断候选抗原基因。

旋毛虫肌幼虫排泄分泌物中特异性诊断抗原的研究

目的 寻找旋毛虫肌幼虫排泄分泌 (ES)物中的特异性诊断抗原。 方法 应用SDS PAGE和Western印迹对旋毛虫肌幼虫体外培养 18、3 0h后的ES抗原中的蛋白组分进行研究。 结果 旋毛虫肌幼虫培养 18、3 0h后得到的ES抗原组分大致相同 ,两种ES抗原中主要蛋白带的分子量为 112、110、10 8、97、5 3、49、45、42、3 5、2 3和 16kDa。18hES抗原中的 10 2、97、95和 5 3kDa以及 3 0hES抗原中的 5 3、49、45和 43kDa均与并殖吸虫病、华支睾吸虫病、日本血吸虫病及囊尾蚴病患者血清发生明显的交叉反应。ES抗原中的 2 3kDa蛋白组分只与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清反应 ,而不与上述其它寄生虫感染者、正常大鼠和小鼠及正常人血清发生交叉反应。 结论 旋毛虫肌幼虫ES抗原中的 2 3kDa蛋白组分为旋毛虫肌幼虫的特异性抗原 ,可用于旋毛虫病的血清学诊断及血清流行病学调查。

旋毛虫成虫、新生幼虫和肌幼虫抗原的保护性免疫研究

目的 比较旋毛虫成虫抗原、新生幼虫抗原和肌幼虫抗原接种小鼠诱导产生的保护性免疫。方法 检查肠道成虫、肌幼虫和血液中嗜酸性细胞数 ;用ELISA测血清中抗旋毛虫肌幼虫IgG抗体滴度。 结果 成虫、新生幼虫和肌幼虫抗原免疫组的成虫减虫率分别为 82 19%、72 31%和 42 88% ;肌幼虫减虫率分别为 6 8 83%、78 19%和 5 1 96 %。血清IgG抗体滴度明显升高 ,成虫、新生幼虫和肌幼虫抗原免疫组的GMRT分别为对照组的 7 46倍、5 2 8倍和 4 92倍。血液嗜酸性粒细胞明显增多。结论 旋毛虫成虫抗原、新生幼虫抗原和肌幼虫抗原均可激发特异性体液免疫和细胞免疫 ,诱导小鼠对攻击感染产生保护性。其中 ,成虫抗原和新生幼虫抗原显示出更好的免疫原性 ,而成虫抗原有可能成为较理想的免疫疫苗来源。

旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原保护性免疫的比较研究

目的:比较旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原诱导小鼠产生保护性免疫效果的异同。方法:制备旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原,分组免疫小鼠,并于末次免疫后10d用旋毛虫感染性幼虫对各组小鼠实施攻击感染,检测攻击感染后各组小鼠肠道成虫和肌肉幼虫数并计算减虫率,同时采用ELISA法检测各组小鼠血清IgG抗体水平。结果:成虫抗原免疫组小鼠和肌幼虫抗原免疫组小鼠检获的肠道成虫数和肌幼虫数均显著少于对照组(P<0.05),其中以成虫抗原免疫组小鼠减虫率最高(P<0.01)。成虫抗原免疫组和肌幼虫抗原免疫组小鼠于实施旋毛虫感染性幼虫进行攻击感染的当日所检测的血清IgG抗体水平与其免疫前相比均升高(P<0.01,P<0.05),与对照组相比亦升高(P<0.01,P<0.05),其中也以成虫抗原免疫组小鼠血清IgG抗体升高最为显著(P<0.01)。结论:旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原均能激发小鼠产生保护性免疫,其中成虫抗原免疫组小鼠显示出更好的抗感染保护性。

旋毛虫成囊前期幼虫抗原的分析与诊断价值的研究

目的研究旋毛虫成囊前期幼虫抗原（pre－encystedlarvaantigens，PELA）的组分和诊断价值。方法应用免疫印迹对比分析PELA和成囊幼虫抗原（ELA）的组分和它们对人及大民旋毛虫病诊断的敏感性和特异性。结果PELA有3条抗原带（分子量分别为：15、17和129kD）与ELA明显不同；对于感染旋毛虫的大鼠，PELA的首次血清阳性反应出现在感染后第10天，而ELA则在感染后第14天，大鼠抗PELA血清抗体出现较早（P＜0．01）；对22份旋毛虫病人血清，PELA的阳性率为100％，ELA为72．7％，差异具有显著性（P＜0．05）；除1例鞭虫病人外，其它寄生虫病入及健康人血清，两种抗原均呈阴性反应，两种抗原的特异性无显著性差异（P＞0．05）。结论PELA比ELA对早期旋毛虫病的诊断著有更大的价值。

旋毛虫成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1的克隆与表达

目的 克隆和表达旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫编码 3 1kDa抗原的结构基因 (TspE1)。 方法 大鼠感染旋毛虫后第 17天收集成囊前期幼虫 ,提取虫体的总RNA。通过RT PCR特异性扩增目的基因 ,构建重组质粒pUC18 Ts HN3 ,将重组质粒 pUC18 Ts HN3中的目的基因亚克隆入原核表达载体pGEMEX 1,构建重组子 pGEMEX 1 Ts HN3 ,经IPTG诱导 ,在E .coliJM 10 9(DE3 )中表达。对表达产物进行SDS PAGE分析和Westernblotting鉴定。 结果 SDS PAGE显示目的基因在大肠杆菌中获得高效表达 ,重组蛋白的分子量为 3 1kDa ,以诱导 4h时表达量最多。薄层凝胶光密度扫描分析结果显示 ,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的 2 6%。Westernblotting证实 ,融合蛋白条带能被感染旋毛虫的大鼠血清及旋毛虫病患者血清识别。 结论 旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1克隆和原核表达成功。

旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p4 6kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。 方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以 2 0 μg/只的剂量分 3次免疫小鼠后 ,攻击感染旋毛虫肌幼虫 2 0 0条 /只 ,检查旋毛虫 7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染 35d的肌幼虫数并计算减虫率 ,同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果 WN10免疫小鼠后获得旋毛虫 7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为 6 4 .2 8%和 6 1.2 1% ,均与感染对照组和佐剂对照组差异显著 ;获得雌虫产新生幼虫的减虫率为 16 .4 6 % ,与感染对照组和佐剂对照组差异不显著 ;WN10免疫组小鼠在第 3次免疫后 1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG ,在攻击感染旋毛虫 9周后仍维持在较高水平。 结论 编码旋毛虫新生幼虫 p4

人工繁育蝇蛆对鸡免疫应答功能的影响

目的 :观察在饲料中添加鲜蛆、进口鱼粉、国产鱼粉对鸡免疫应答功能的影响。方法 :选成年罗曼褐壳蛋鸡 ,在基本饲料相同的前提下 ,添加鲜蝇蛆、进口鱼粉、国产鱼粉养鸡 ,每种饲料均设全量和减量两组 ,共 6组 ,每隔一定时间以伤寒沙门菌O抗原免疫 ,测定血清凝集效价和脾脏指数 ,观察鸡的免疫应答情况 ,每组随机设立未免疫对照。结果 :血清凝集效价各全量组之间差别无显著性意义 (P >0 0 5 ) ,减量鲜蝇蛆和减量国产鱼粉差别无显著性意义 (P >0 0 5 ) ,但均高于减量进口鱼粉组 (P <0 0 5 ) ;各饲料减量组凝集效价均明显高于全量组 (P <0 0 5 ) ;脾脏增大以全量和减量鲜蛆组、全量进口鱼粉组、减量国产鱼粉组最为明显 ,增大率达 77 2 8%(P <0 0 0 1 )。结论

肌幼虫可溶性抗原免疫小鼠抗旋毛虫感染作用

目的观察不同剂量旋毛虫肌幼虫可溶性抗原(muscle larvae soluble antigen,MLSAg)滴鼻免疫小鼠诱导的抗旋毛虫感染作用,确定MLSAg滴鼻免疫适宜剂量。方法C57BL/6J小鼠50只,随机分为5组,分别用5,10,20,30μg MLSAg溶于20μl生理盐水滴鼻免疫小鼠2次,间隔2周;对照组用0.9%NaCl20μl滴鼻。末次免疫后7d,用旋毛虫肌幼虫150条/只灌胃攻击全部小鼠,观察健康状况,记录体重。攻击后28d,检测血清和肠液IgG、IgA。计数舌肌、咬肌、膈肌及后肢肌肉的虫荷。结果攻击后对照组小鼠体重逐渐减轻,而4个免疫组小鼠体重仍呈增高趋势。5,10,20和30μg组小鼠血清IgG水平分别为1.255,1.281,1.394和1.441;血清IgA水平分别为1.108,1.282,1.262和1.326,均高于对照组(1.158,1.035)。肠液IgA水平分别为1.974,2.026,2.057和2.015明显高于对照组(1.785);10,20和30μg组小鼠肌肉虫荷均明显低于对照组及5μg组(P<0.05)。结论不同剂量MLSAg滴鼻免疫小鼠均可诱导抗旋毛虫感染,滴鼻免疫剂量以20μg为佳。

旋毛虫成囊前期幼虫编码31kDa抗原基因的分子克隆及序列分析

目的 克隆旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原基因 (TspE1)片段 ,并测定其基因序列 ,以了解该基因序列与已报道虫株的差异。方法 根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物 ,采用RT -PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因 ,PCR产物经纯化后用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切 ,定向克隆入pC18质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9;重组质粒用BamHⅠ +HindⅢ酶切及PCR扩增鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定 ,应用DNASIS软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果 RT -PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因 (约 870bp) ,EcoRⅠ酶切鉴定正确 ;筛选出 7个阳性克隆 ,对目的基因的测序结果显示有 5种类型 ,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列有较高同源性 ,尤其是Ts HN3核苷酸及氨基酸序列同源性分别达 99 6 %和 98 9% ;TspE1基因中可能存在 7个抗原表位。 结论 应用RT -PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原结构基因 ,证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达 ;

旋毛虫与伪旋毛虫肌幼虫抗原的SDS-PAGE和双向电泳分析

目的鉴定旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)与伪旋毛虫(T.pseudospiralis,T4)肌幼虫的差异蛋白。方法应用SDS-PAGE和双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)对T1、T4肌幼虫的可溶性抗原与培养24h的ES抗原的蛋白组分进行分析。结果SDS-PAGE显示,T1肌幼虫可溶性抗原有22条蛋白带(221.62kDa～14.88kDa),其中6条为T1特异性蛋白带(59.72、44.37、23.66、22.36、18.26、16.34kDa);T4可溶性抗原蛋白有18条带(185.28kDa～14.27kDa),其中4条为T4特异性蛋白带(132.60、119.30、35.26、31.02kDa)。T1的ES抗原有10条蛋白带(113.21kDa～14.37kDa),T4的ES抗原有9条蛋白带(104.71kDa～14.51kDa),T1、T4肌幼虫ES抗原的蛋白带均不相同。2-DE显示,T1可溶性抗原有193±12个蛋白点,分子量主要为11kDa～22kDa、25kDa～64kDa及100kDa～144kDa,所对应的等电点(pI)分别为4.7～8.2、4.5～6.5及5～7;T4可溶性抗原有175±9个蛋白点,分子量主要为12kDa～21kDa及25kDa～90kDa,所对应的pI分别为4～9.5与4.5～9.6。T1的ES抗原具有82±6个蛋白点,分子量主要为13kDa～16kDa、18kDa～22kDa及40kDa～55kDa,所对应的pI分别为4～7、3.8～6.2及5～9;T4的ES抗原具有69±5个蛋白点,分子量主要为10kDa～15kDa、17kDa～25kDa及29kDa～55kDa,所对应的pI分别为4.7～6.5、4.6～6及5～7。结论旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原的蛋白组分与伪旋毛虫的明显不同。

旋毛虫肌肉期幼虫分泌排泄物中特异性抗原的分析

用胃蛋白酶消化旋毛虫感染鼠肌肉，获得肌肉期幼虫。３７℃，用ＲＰＭＩ１６４０培养基培养幼虫，控制虫体死亡率低于５％。每２４ｈｒ收集上清培养液，即为分泌排泄抗原（ＥＳＡ）。共获１０天次ＥＳＡ（ＥＳＡ＿（１ｄ～１０ｄ））。应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及氨银染色技术进行蛋白组份分析显示：各天次ＥＳＡ的主要蛋白区带数及位置基本相同，分子量范围在９６～１４ｋｄ，主带３条，分别为４８，５３和５８ｋＤ蛋白组份。应用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技术进行免疫识别分析显示：旋毛虫病人血清对各天次ＥＳＡ的免疫识别结果相似，识别的抗原组份有７～８条区带，均有上述３条主带。正常人、蛔虫病人和囊虫病人血清均未能识别任何区带。肺吸虫病人血清能识别２～３条抗原区带，但其分子量位于２４～１４ｋＤ之间。血吸虫病人血清也能识别２～３条抗原区带，其分子量位于１８～１４ｋＤ之间。结果表明：在严格控制死亡虫体抗原污染条件下，较长期内培养肌肉期幼虫获得的各天次ＥＳＡ，其成份和免疫识别效果基本无改变，各天次ＥＳＡ中的４６～５８ｋＤ蛋白均具有良好的特异性。

旋毛虫成囊前期幼虫17000抗原组分的免疫诊断价值

目的 :研究旋毛虫成囊前期幼虫抗原 (PELA) 170 0 0组分的免疫诊断价值。方法 :应用聚丙烯凝胶电泳(SDS PAGE)和转印技术分离PELA 170 0 0蛋白组分 ,用ELISA检测实验感染旋毛虫的Wistar大鼠和旋毛虫病患者血清抗体 ,并以PELA和成囊期幼虫抗原 (ELA)为对照。结果 :对于感染旋毛虫的大鼠 ,170 0 0组分和PELA的首次血清阳性反应出现在感染后第 10d ,而ELA则在感染后第 14d ,其差异具有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;对 4 8份旋毛虫病患者血清 ,170 0 0抗原的阳性率为 95 .8% ,PELA和ELA的阳性率均为 10 0 % ,3种抗原之间差异均无统计学意义 (P>0 .0 5 )。 170 0 0抗原与其他寄生虫病患者及健康人血清无反应 ,而PELA和ELA均与肺吸虫病、鞭虫病患者血清有反应 ,差异均具有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论 :与PELA和ELA相比 ,PELA 170 0

旋毛虫幼虫抗原的免疫组化定位及组织化学分析

运用免疫组化定位法及组织化学分析法对旋毛虫幼虫虫体抗原及相应部位化学成分进行了研究。旋毛虫幼虫抗原活性物质被定位于幼虫角皮层、杆状体细胞、咽管和肠道内。幼虫囊包液亦显示了较强的抗原活性。组织化学分析表明，抗原相应部位具有较强的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、乙酰胆碱醋酶等酶活性，并富含蛋白质、糖原及ＰＡＳ阳性物质和一定程度的中性脂肪。ＤＮＡ主要存在于生殖原基和肠细胞核；ＲＮＡ在多种细胞内可以查见。

旋毛虫肌幼虫特异性抗原的鉴定

目的 寻找诊断旋毛虫病的特异性抗原。方法 应用SDS-PAGE和Western blot对旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的蛋白组分进行研究。结果 旋毛虫肌幼虫可溶性抗原经SDS-PAGE后显示29条蛋白带,分子量范围在112—12 kDa之间,其中65、43、42、31、30、20、17、16 kDa为主带。112、110、108、102、97、95、65、63、58、55、53、49、45、43、42 kDa蛋白组分与并殖吸虫感染的大鼠及患者血清、华支睾吸虫病、血吸虫病及囊尾蚴病患者血清均具有明显的交叉反应带;24—20 kDa蛋白组分只与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清反应,而不与其它寄生虫感染的动物或患者血清、正常大鼠和小鼠及正常人血清发生交叉反应。结论 旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中24—20 kDa蛋白组分为旋毛虫肌幼虫的特异性抗原,可用于旋毛虫病的免疫学诊断及血清流行病学调查。

旋毛虫新生幼虫抗原的免疫印迹分析

利用免疫印迹法分析了旋毛虫的新生幼虫(NBL)抗原,并与旋毛虫的成虫和肌肉期幼虫抗原加以比较。NBL虫体组分经SDS-PAGE分离出约40条区带,与成虫和肌肉期幼虫的电泳图谱明显不同。免疫印迹表明,用NBL作免疫原可诱导家兔产生具有期特异性的免疫反应,其有抗原性的分子量分别为129、120、89、87、79、72、64、58、43、40、38、34、32和20kDa。但在自然感染过程中,宿主体内未检测到抗NBL的抗体。