表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

【目的】重组新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21d分别以vvIBDVGx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV-VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120h,脑内致病指数(ICPI)分别为0.4和0.36,静脉内致病指数(IVPI)均为0;接种后72～96h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏,免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100%保护,对vvIBDV攻击免疫保护率达90%以上。【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性,免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病-新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。

猪脾转移因子提高LaSota株鸡新城疫弱毒疫苗的免疫保护率

旨在了解猪脾转移因子(TF)对新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗LaSota株的免疫增强效果及机制。本研究分别采用不同剂量(10^(-2)、10^(-3)、10^(-4)、10^(-5)羽份)LaSota疫苗株单独(单独免疫组)、LaSota疫苗株与TF联合(联合免疫组)免疫SPF鸡,14 d后以NDV F 48 E 9强毒攻毒,同时设立对照组(非免疫攻毒)和空白组(非免疫非攻毒),并采用ELISA方法与蛋白质芯片技术分别测定外周血IL-4、IFN-γ与IL-12 P40浓度。结果显示,鸡免疫10^(-2)、10^(-3)、10^(-4)、10^(-5)羽份时疫苗攻毒保护率和半数保护量(PD_(50))如下:单独免疫组分别为100%、55%、0%、0%和0.0008羽份,联合免疫组分别为100%、75%、0%、0%和0.0005羽份,对照组和空白组死亡率分别为100%和0%。免疫10^(-3)羽份疫苗后,联合免疫组IL-4和IFN-γ含量均高于其他组,并于第7、14天差异极显著(P<0.01);攻毒后,联合免疫组IL-4、IFN-γ和IL-12 P40含量均高于其他组,IL-4于第1、14天,IFN-γ于第1、3天,IL-12 P40于第1天差异极显著(P<0.01)。综上表明,TF可增强IFN-γ、IL-12介导的细胞免疫和IL-4介导的体液免疫,提高LaSota株弱毒疫苗的免疫保护率,降低疫苗PD_(50);在抵抗NDV F 48 E 9强毒攻击时,联合免疫组的免疫保护率明显高于单独免疫组。

H5亚型血凝素基因的插入对重组LaSota毒株在组织中病毒分布的影响

为了研究外源基因H5亚型血凝素基因插入到NDV后对重组LaSota毒株在组织中对NDV病毒分布的影响,用构建的rL-F(M)-FHA和rL-FHA与亲本毒株重组LaSota野毒株(rLaSota)经滴鼻、点眼免疫SPF雏鸡,分别在免疫后1 d、3 d、5 d、10 d、15 d和18 d后采集病料(气管、肝脏,肺脏、肾脏、大脑、脾脏、腺胃、十二指肠),利用免疫组化染色方法检测病毒在机体内的分布。H5亚型血凝素基因的插入对NDV病毒分布、病毒在组织中出现时间有很大影响,而F基因突变株的变化也是影响病毒分布、病毒在组织中出现时间的主要因素。

新城疫病毒Lasota株F基因的克隆和序列分析

本试验采用RT-PCR方法对NDVLasota株的全长F基因进行了扩增与克隆,并对其进行测序。扩出的F基因核苷酸长度为1664bp,单一的开放阅读框编码553个氨基酸的长肽,序列中有6个糖基化位点,13个半胱氨酸残基,包括完整的F1片段和完整的F2片段。裂解位点区(112-117aa)氨基酸序列为Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Leu,与所有弱毒株在这一区域的序列(Gy-Arg/Lys-Gln-Gly/Ser-Arg-Leu)相符。同源性分析表明,Lasota株F基因与已发表的其它NDVF基因相比,核苷酸序列同源性在88%～99%之间,推导的氨基酸序列同源性在90%～99%之间。

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID_(50))的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID_(50)绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID_(50)、鸡胚半数感染量(EID_(50))与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10^(6.375) EID_(50),细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID_(50)值为10^(7.0)/0.1 mL,EID_(50)为10^(7.5)/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。

新城疫病毒Lasota株基因组全长cDNA的构建与序列分析

将Lasota病毒RNA反转录为cDNA,按照GenBank上公布的Lasota基因组序列(AF 077761)设计了5对引物进行全基因组的扩增(RT-PCR),并将各个片段连于克隆载体pMD_(18)-T,获得高拷贝的基因序列,然后通过酶切连接将测序正确的各个片段连接到pET-30a载体。PCR分片段扩增、酶切鉴定及测序结果表明,所构建的Lasota全基因组cDNA基因序列正确,连入载体的位置与预期完全一致。

拯救新城疫病毒LaSota株辅助质粒的构建

本实验室保存的LaSota株新城疫病毒经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液并纯化病毒,提取病毒基因组RNA。参考GeneBank收录的LaSota株新城疫病毒基因组序列,设计6对特异性引物,分别扩增病毒的NP、P和L1～L4六个基因片段,并将目的片段回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒并酶切鉴定,鉴定正确的样品进行序列测定,并比对测序结果。结果证明测序结果与GeneBank上公布的LaSota株新城疫病毒序列完全一致,没有任何氨基酸和核苷酸的变化,将NP、P、L分别连接至pVAX载体,其中L1～L4为顺次连接。鉴定结果表明NP、P和L基因已正确克隆至pVAX表达载体,证明3个辅助质粒构建成功,分别命名为pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L。

低血凝价新城疫LaSota株病毒免疫原性的研究

用血凝价分别为0、7、8的三批新城疫LaSota株病毒制备的油乳剂疫苗免疫60日龄蛋鸡,疫苗免疫10d后HI抗体水平平均值分别为3.9Log2、5.2Log2、5.9Log2,免疫后20dHI抗体水平升到高峰(4.0Log2、8.1Log2、7.9Log2),免疫60d后用剂量为100ELD50的同种毒攻击。结果表明,血凝价为0的新城疫LaSota株病毒抗原制备的油乳剂免疫效果较差,不能抵御病毒的攻击,但血凝价为7和8的两批病毒抗原能抵御病毒的攻击,并与血凝价为9的病毒抗原的免疫原性无显著差异。

新城疫病毒诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究

目的 研究新城疫病毒Lasota株 (NDV -L)杀伤肿瘤细胞及诱导肿瘤细胞凋亡的作用。方法 通过噬斑形成单位、HA效价、MTT法等方法检测NDV -L对细胞的杀伤作用 ;通过Giemsa’s染色法、倒置相差显微镜、透射电镜、DNA凝胶电泳、流式细胞仪检测NDV -L诱导肿瘤细胞凋亡的作用。结果 NDV对肿瘤细胞有选择性杀伤作用。经NDV -L诱导后 ,肿瘤细胞呈现典型的凋亡特征。结论 NDV除通过自身复制直接杀伤肿瘤细胞外 ,还具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗株组织嗜性的研究

为了研究H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗株[La Sota-HAmut(GD)]的组织嗜性,用重组疫苗[La Sota-HAmut(GD)]人工感染2日龄SPF鸡,接种后定期采集病鸡的各组织器官制备成石蜡切片,用建立的检测石蜡切片中[rLa Sota-HAmut(GD)]病毒的免疫酶组化染色技术,对人工感染[rLaSota-HAmut(GD)]鸡发病后病毒的组织器官亲嗜性和动态分布规律进行研究。[rLa Sota-HAmut(GD)]在胞浆内复制,主要亲嗜气管黏膜的上皮细胞和固有层腺体细胞,肝小叶间胆管上皮细胞。病毒出现的先后顺序为气管,肝脏,肺脏。结果表明:外源基因HAmut的插入对LaSota疫苗株的组织嗜性的影响很大。

rL-RVG通过拮抗α7烟碱型乙酰胆碱受体影响胃癌细胞凋亡及增殖

目的:探讨表达狂犬病毒糖蛋白(RVG)的重组La Sota株新城疫病毒(recombinant La Sota strain NDV expressing the rabies virus glycoprotein,rL-RVG)是否通过α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR)影响胃癌细胞HGC的增殖与凋亡。方法:将rL-RVG、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)和PBS分别感染胃癌HGC细胞24 h后,采用蛋白质印迹法检测RVG、NDV、pro-caspase 3蛋白和α7-nAChR在HGC细胞中的表达,免疫荧光检测α7-nAChR在HGC细胞中的表达,MTT检测HGC细胞的增殖情况。将HGC细胞随机分为rL-RVG组、rL-RVG+α7-nAChR抑制剂组、rL-RVG+α7-nAChR激动剂组,NDV组、NDV+α7-nAChR抑制剂组、NDV+α7-nAChR激动剂组,PBS组、PBS+α7-nAChR抑制剂组、PBS+α7-nAChR激动剂组;倒置显微镜下观察各组细胞形态,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白pro-caspase 3、bax、bcl-2表达水平。结果:蛋白质印迹结果显示,病毒感染HGC细胞24 h后,NDV、pro-caspase 3蛋白和α7-nAChR在rL-RVG组、NDV组的表达均显著高于PBS组(P均<0.01),RVG蛋白在rL-RVG组表达显著高于NDV组和PBS组(P均<0.01);免疫荧光显示α7-nAChR在rLRVG组中明显高于NDV组和PBS组。MTT结果显示两种病毒浓度大于10-5mmol/L对细胞的增殖有明显抑制作用(P<0.05)。倒置显微镜下可见NDV+α7-nAChR抑制剂组、PBS+α7-nAChR抑制剂组HGC细胞分别较NDV组、PBS组皱缩、凋亡更明显,但rL-RVG组与其α7-nAChR抑制剂组相比细胞皱缩、凋亡差异不明显;rL-RVG+α7-nAChR激动剂组、NDV+α7-nAChR激动剂组、PBS+α7-nAChR激动剂组HGC细胞皱缩、凋亡分别较rL-RVG组、NDV组、PBS组明显减弱。蛋白质印迹显示bcl-2、bax和pro-caspase 3蛋白在rL-RVG+α7-nAChR抑制剂组的相对表达量与rL-RVG组无显著性差异(P均>0.05),但在NDV+α7-nAChR抑制剂组、PBS+α7-nAChR抑制剂组的相对表达量分别较NDV组、PBS组显著上调(P均<0.01);rL-RVG+α7-nAChR激动剂组、NDV+α7-nAChR激动剂组、PBS+α7-nAChR激动剂组的bax、pro-caspase 3蛋白相对表达量分别较rL-RVG组、NDV组和PBS组明显下调(P均<0.01),bcl-2蛋白相对表达量则明显上调(P均<0.01)。结论:rL-RVG感染HGC后稳定表达,可能通过拮抗α7-nAChR途径促进胃癌细胞的凋亡和抑制其增殖。

重组基因Ⅶ型新城疫病毒疫苗候选株的构建

新城疫是我国必须控制和净化的传染病之一,疫苗免疫是防控疾病的重要手段。为获得抗原性匹配的疫苗株,以新城疫LaSota疫苗株为骨架,替换当前流行的基因Ⅶ型毒株GM株的主要抗原性相关基因F(Fusion)和HN(Hemagglutinin-neuraminidase),拯救获得重组病毒rLa-mGM。生物学特性测定表明,重组毒株的MDT为160 h,ICPI为0,EID_(50)为10^(-8.4)/0.2 mL。将rLa-mGM株繁殖后以10^(8.0) EID_(50)制备灭活疫苗,与商品化LaSota疫苗各免疫10只25日龄SPF鸡,0.2 mL/只。免疫后14天,其血清平均HI效价为7.6log2,商品化LaSota疫苗免疫鸡的血清平均HI效价为7.4log2。结果表明重组病毒免疫原性良好,可作为疫苗候选株。

滴鼻接种不同剂量新城疫疫苗对塞北乌骨鸡免疫效果的影响

随机选取1日龄塞北乌骨鸡240只,随机分为4组,每组60只,在同一饲养条件下,每组鸡按常规免疫程序进行基础免疫后,饲养至35日龄,分别用2、3、4、5倍剂量新城疫疫苗滴鼻接种,测定血清抗体效价和免疫器官指数。结果表明:3倍量的新城疫疫苗滴鼻免疫塞北乌骨鸡产生的抗体效价显著高于其他各组,对免疫器官指数的促进作用也明显,是适宜的免疫剂量。