蜡蚧轮枝菌Lecanicillium lecanii次生代谢产物对烟粉虱Bemisia tabaci的忌避作用模型

蜡蚧轮枝菌Lecanicillium lecanii(Z imm.)viegas V l6063菌株在2种不同培养基发酵培养后,经萃取、干燥浓缩得到4种不同的毒素粗提物(次生代谢产物),用均匀设计法设计实验方案研究了4种不同毒素粗提物对4种不同寄主植物上烟粉虱Bem isia tabaci(Gennad ius)成虫的忌避作用,并构建了模型,分析结果表明,忌避作用与毒素粗提物浓度显著相关,忌避率随毒素粗提物浓度增大而增大,1 g/L浓度的毒素粗提物忌避率与烟粉虱的寄主植物相关不显著,毒素的忌避作用与培养基相关不显著,从菌株发酵的菌丝体和发酵液中提取的毒素粗提物的忌避率差异不显著。

根结线虫卵寄生真菌蜡蚧菌(Lecanicillium lecanii)产生的几丁质酶活性

卵寄生真菌产生的几丁质酶在卵孵化和寄生过程中发挥重要的作用,也是评价寄生线虫真菌生物防治潜力重要的生化指标之一。利用NAG法和pNP法分别测定蜡蚧菌(Lecanicillium lecanii)CFCC84957和CFCC80920菌系的几丁质降解酶系和外切酶活性,CFCC84957菌系接种4～6d含有0.2%胶体几丁质的培养滤液后,几丁质降解酶系到达活性高峰期,而CFCC80920菌系的培养滤液未检测到几丁质降解酶系。2个菌系的培养滤液从第2d开始均能检测到几丁质外切酶活性,CFCC84957和CFCC80920活性出现的最高峰分别在第12d和6d,但是CF-CC84957的活性值约是CFCC80920的4倍(分别为0.51μmol·h-1·ml-1、0.12μmol·h-1·ml-1)。含有0.01%糖基化几丁质的几丁质酶活性电泳检测到1条分子量为48.2kD的蛋白质谱带。

蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)Bj085-1菌株对烟粉虱的毒力测定

蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)Bj085-1菌株分生孢子配成1.1×104～1.1×108孢子/mL的5个处理浓度,以京郊尚未喷药的温室采集的烟粉虱(Bemisia tabaci)为试材,采用点滴法对其2龄若虫进行室内毒力测定。结果表明,浓度为1.1×104孢子/mL的Bj085-1分生孢子对烟粉虱若虫的LT50为11.568 d,且随浓度增加其杀虫速度加快。浓度增至1.1×106孢子/mL时,杀虫速度最快,尔后,随着浓度增加速度又有所下降。此外,将Bj085-1菌株经大米培养基培养所得分生孢子配成1.1×107孢子/mL的处理浓度,分2次(间隔7 d)对田间置于纱笼罩栽植的清洁番茄苗上3个不同虫口密度的烟粉虱若虫进行低量喷施防治试验。结果表明,Bj085-1菌株对室外笼罩中的烟粉虱也具有较好的防治效果。

蜡蚧轮枝菌的新株系(Lecanicillium lecanii-01Et)对介壳虫的毒力测定

对从未喷药的中国农业大学校园露地栽培的辣根上采集的介壳虫制作成永久玻片后进行鉴定,初步判断为梨绒蚧(Eriococcus tokaedae Kuwana)。将蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)Bj085-1菌株分生孢子配成(1.4×104)～(1.4×108)孢子/mL的5个处理浓度,对梨绒蚧若虫进行第1次毒力测定。结果显示,各个处理浓度之间的平均累计死亡率大致随着孢子浓度的增加而增加,其中以(1.4×108)孢子/mL浓度处理的最高,但只有45.7%。其后将第1次毒力测定试验中死亡虫体经保湿后出现的菌丝体进行分离纯化,获得了新株系(Lecanicillium lecanii-01Et)进行第2次毒力测定(方法同第1次)。结果表明,不同浓度的L.lecanii-01Et分生孢子对梨绒蚧若虫的杀虫速度随浓度的增加而明显加快,浓度增至(1.4×108)孢子/mL时,杀虫速度最快,LT50仅为3.95 d,平均累计校正死亡率达84.1%。说明分离纯化后的蜡蚧轮枝菌新株系(L.lecanii-01Et)分生孢子对梨绒蚧若虫有较好的防治作用。

蜡蚧轮枝菌和缨小蜂对假眼小绿叶蝉的协同控制作用

研究了假眼小绿叶蝉(Empoasca vitis)的寄生蜂缨小蜂(Schizophragma parvulas)和寄生真菌蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)单独使用和联合使用时对假眼小绿叶蝉种群的控制作用。结果表明,在单独进行控制时(在一个世代内按每株放雌蜂3头的密度释放缨小蜂,或按5×107孢子/mL施菌2次),对假眼小绿叶蝉种群的控制效果分别达到52.7%和50.9%,但下一代假眼小绿叶蝉种群增长趋势指数仍然高于1,表明单独使用寄生蜂缨小和寄生真菌蜡蚧轮枝菌不能有效控制假眼小绿叶蝉种群的增长;缨小蜂和蜡蚧轮枝菌联合使用,对假眼小绿叶蝉种群的控制效果分别达82.9%和90.8%,且下一代假眼小绿叶蝉种群增长趋势指数低于1,表明下一代假眼小绿叶蝉种群数得到有效控制。

蜡蚧轮枝菌V3450菌株对榕管蓟马及斯氏钝绥螨的毒力比较

【目的】比较蜡蚧轮枝菌V3450菌株对榕管蓟马及斯氏钝绥螨的毒力差异，为利用天敌昆虫和虫生真菌协同控制榕管蓟马等害虫提供技术支持。【方法】室内测定榕管蓟马成虫和斯氏钝绥螨雌成螨受蜡蚧轮枝菌V3450菌株侵染后的死亡趋势，构建时间剂量死亡率（TDM）模型，比较供试菌株对榕管蓟马成虫及斯氏钝绥螨雌成螨的LC50和LT50。【结果】 蜡蚧轮枝菌V3450菌株侵染后，榕管蓟马和斯氏钝绥螨的死亡趋势均随菌剂浓度的升高及侵染时间的延长而上升，但榕管蓟马的累计校正死亡率及死亡趋势的变幅均明显高于斯氏钝绥螨，其中1.00×107和1.00×108 mL-1蜡蚧轮枝菌V3450菌株侵染10 d，斯氏钝绥螨雌成螨的累计校正死亡率分别仅是榕管蓟马成虫的13.30%和27.94%。构建的榕管蓟马和斯氏钝绥螨TDM模型均能通过Pearson χ2和HosmerLemeshow检验，拟合结果与试验观察结果相吻合，能够无偏地描述蜡蚧轮枝菌V3450菌株对榕管蓟马成虫和斯氏钝绥螨雌成螨的时间剂量互作效应。蜡蚧轮枝菌V3450菌株对榕管蓟马的剂量和时间效应均明显强于斯氏钝绥螨，5个不同浓度蜡蚧轮枝菌V3450菌株对斯氏钝绥螨雌成螨的LT50均超出TDM模型估测范围，斯氏钝绥螨雌成螨受侵染3 d后的LC50是同一侵染时间榕管蓟马成虫LC50的2.51×102～1.29×105倍。【结论】蜡蚧轮枝菌V3450菌株对榕管蓟马的毒力较强，而对斯氏钝绥螨的毒力较弱，榕管蓟马对供试菌株时间剂量互作效应的响应要远强于斯氏钝绥螨。

蜡蚧轮枝菌生物学特性及其与榕母管蓟马毒力的相关性

【目的】探讨蜡蚧轮枝菌生物学特性与菌株对榕母管蓟马毒力的相关性,为榕母管蓟马优质高效生防菌株的初步筛选提供参考。【方法】室内观察蜡蚧轮枝菌V07、V16063、V3450和Vp28 4株菌株的生物学特性,测定其对榕母管蓟马成虫的毒力,通过逐步回归分析探讨两者间的相关性。【结果】4株蜡蚧轮枝菌菌株的生物学特性存在异同,产孢量和孢子萌发率均很高,但V3450菌株生长速度最快,孢子GT50最短;V16063和Vp28菌株生长速度较快,孢子GT50较短;V07菌株生长速度最慢,孢子GT50最长。榕母管蓟马成虫受供试菌株侵染后的死亡趋势均随菌剂浓度升高和侵染时间延长而上升,但不同菌剂中的变幅则明显不同,侵染致死效果依次为V3450>V16063>Vp28>V07,LT50依次为V3450<V16063<Vp28<V07。逐步回归分析表明,菌株生长速度和孢子GT50对累计校正死亡率和LT50的作用均达显著水平。【结论】在供试菌株产孢量和孢子萌发率均很高时,菌株生长速度和孢子GT50可作为评判蜡蚧轮枝菌对榕母管蓟马毒力大小的初筛指标。

蜡蚧轮枝菌分生孢子在不同虫态棕尾!麻蝇体表的附着能力及与寄主体表结构的关系

【目的】为解释蜡蚧轮枝菌Lecanicillium lecanii对棕尾别麻蝇Boettcherisca peregrina成虫、蛹和幼虫等3种虫态的致病性差异,研究分析了蜡蚧轮枝菌L.lecanii分生孢子在3种虫态体表的附着能力及与寄主体表结构的关系。【方法】采用血球计数板计数法测量蜡蚧轮枝菌分生孢子在棕尾!麻蝇B.peregrina成虫、蛹和幼虫体表的附着数量,并利用扫描电子显微镜等显微技术观察供试虫体体壁外长物分布情况以及附着分生孢子情况。【结果】蜡蚧轮枝菌分生孢子在棕尾!麻蝇3种虫态上的附着数量差异显著(P=0.0001),成虫附着孢子数量为(1.35±0.12)×106个/头,而蛹和幼虫分别为(0.57±0.09)×106个/头和(0.45±0.06)×106个/头。成虫周身微毛上均有孢子附着;整个蛹体仅棘刺底部呈"绳索状"的褶皱处可发现有孢子的附着;幼虫的体表未发现有孢子的附着。【结论】蜡蚧轮枝菌分生孢子在棕尾!麻蝇成虫、蛹、幼虫体表的附着能力与寄主体表结构有密切关系,是蜡蚧轮枝菌对该虫不同虫态间存在致病差异的原因。

家蝇不同虫态附着蜡蚧轮枝菌分生孢子能力及与其体表结构的关系

【目的】研究家蝇成虫、幼虫和蛹附着蜡蚧轮枝菌分生孢子的能力及与其体表结构的关系,为解释虫生真菌对同一昆虫不同虫态间的致病性差异提供科学依据。【方法】采用2种不同接菌方法(浸泡虫体法、喷雾虫体法),通过血球计测量家蝇3种虫态(成虫、幼虫和蛹)体表附着的蜡蚧轮枝菌分生孢子数,并利用扫描电子显微镜等显微技术观察3种虫态的体表超微结构及附着分生孢子情况。【结果】2种接菌方法测得家蝇3种虫态附着的蜡蚧轮枝菌分生孢子数量差异显著(P<0.05),均表现为成虫>蛹>幼虫。显微观察发现,家蝇成虫周身密集着刚毛、鬃和微毛等体壁外长物,微毛上附着大量的蜡蚧轮枝菌分生孢子,孢子分泌粘液进一步加强附着作用;蛹体大量分布着呈环状的皱褶,在体节接合处有稀疏的棘刺带,蛹体上无分生孢子附着;幼虫体表几乎无皱褶,只在体节接合处附近有带状棘刺,其体表也无孢子附着。【结论】家蝇成虫、幼虫和蛹附着蜡蚧轮枝菌分生孢子的能力与其体表结构有密切关系。

基质诱导培养蜡蚧轮枝菌蓟马防控菌株的胞外酶活性及毒力变化

测定比较蜡蚧轮枝菌V07、V16063、V3450和Vp28等4株蓟马防控菌株在基质诱导培养前后的胞外酶活性及毒力变化。结果表明:基质诱导培养后供试菌株的胞外酶活性均有不同幅度的提高,蛋白酶活性提高幅度次序为V3450>V16063>V07>Vp28,几丁质酶活性提高幅度次序为Vp28>V07>V3450>V16063,但这种提高不会最终改变他们胞外酶活性的高低次序;基质诱导培养后供试菌株对榕母管蓟马成虫的毒力也均有明显提升,提升幅度次序为V16063>V3450>V07>Vp28,但不同菌株间毒力的高低次序也不会因基质诱导培养而改变。可见,基质诱导培养虽可不同幅度地提高蓟马防控菌株的孢外酶活性及毒力,但不会改变不同菌株间孢外酶活性及毒力的高低次序。

福建甜椒蓟马发生情况及蜡蚧轮枝菌对蓟马优势种的致病力

【目的】明确福建甜椒蓟马发生情况及蜡蚧轮枝菌对蓟马优势种的生防潜力。【方法】以主产地漳州的甜椒种植基地为观测点,调查3种甜椒品种上蓟马的种类和数量,测定蜡蚧轮枝菌LL-01对甜椒蓟马优势种的致病力。【结果】甜椒路帅品种和布兰妮品种上蓟马数量近似且均显著高于特雅斯品种;甜椒上有花蓟马、黄胸蓟马和棕榈蓟马3种蓟马,其中花蓟马的相对丰度高达91.31%~94.93%。菌株LL-01侵染花蓟马7 d后的LC_(50)达3.47×10^(5)孢子·mL^(−1),1×10^(7)~1×10^(8)孢子·mL^(−1)处理的累计致死率为78.16%~87.36%,LT_(50)为3.73~4.24 d。【结论】蓟马对不同甜椒品种的嗜好性不同,花蓟马为优势种;蜡蚧轮枝菌LL-01对花蓟马的致病力强,可用于该虫的生物防治。

有机溶剂对蜡蚧菌几丁质酶的影响

以蜡蚧菌（LI）发酵液为材料，经硫酸铵沉淀、离子交换和凝胶过滤，获得部分纯化的LI几丁质酶（EC3．2．1．14）制剂。研究了不同有机溶剂对LI几丁质酶的影响。结果表明，丙三醇、甲醛和戊二醛对几丁质酶有抑制作用；丙酬对酶有激活作用；甲醇、乙醇、正丁醇和乙二醇在低浓度时对酶有激活作用，随着浓度的升高表现出抑制作用；二氧六环的浓度低于6％时对酶的影响不明显，而高于6％时对酶则有激活作用。

2株蜡蚧轮枝菌耐热性差异分析

采用菌丝生长速率法和孢子萌发法比较蜡蚧轮枝菌不同菌株VL17和VL18菌株菌丝和分生孢子耐热性的差异,喷雾接菌法测定两菌株高温胁迫下的杀蚜毒力,qPCR法研究高温胁迫后热激蛋白sHsp和Hsp70基因的表达量,初步探索热激蛋白抗高温胁迫的作用机制。结果显示,VL18菌株菌丝和分生孢子对高温的耐受性显著好于VL17菌株,34℃时VL18菌株的菌落直径比VL17大63.16%,37℃时VL18分生孢子萌发率比VL17高103%;温度高于31℃时两者的杀蚜活性差异显著,37℃时VL18对蚜虫的校正死亡率比VL17高166.67%;42℃时胁迫相同时间,VL18的sHsp和Hsp70基因表达量均高于VL17,胁迫120min时VL18的Hsp70和sHsp基因表达量分别是VL17的16.97倍和63.74倍。两菌株sHsp基因的表达量均明显高于Hsp70基因。通过比较分析认为小分子热激蛋白sHsp对蜡蚧轮枝菌抗高温胁迫起重要作用。

榕管蓟马防治高效菌株蜡蚧轮枝菌V3450固态发酵基质配方筛选

蜡蚧轮枝菌V3450是榕管蓟马防治的高效菌株,为实现该菌株的放大培养,以盆栽榕树出口使用的主要栽培基质椰糠和单一固态发酵培养产孢量最多的麦麸为主载体,开展该菌株的固态发酵基质一般组合配方和正交组合配方筛选试验。结果表明:一般组合固态发酵基质配方5(椰糠+麦麸+磷酸盐+酵母粉=7.5 g+7.5 g+0.2 g+0.5 g)为最好的初筛配方,蜡蚧轮枝菌V3450菌株固态发酵培养所需基质的4个基本组分因子为麦麸、椰糠、磷酸盐和酵母粉;正交组合固态发酵基质配方8(麦麸:椰糠:磷酸盐:酵母粉=3:2:3:2)为最佳的组合配方,麦麸、椰糠、磷酸盐和酵母粉等4个基本组分因子的最佳质量配比为3:2:3:2。正交组合配方8(麦麸:椰糠:磷酸盐:酵母粉=3:2:3:2)是蜡蚧轮枝菌V3450菌株的最佳固态发酵基质配方,放大培养的真菌孢子对榕管蓟马成虫具有很强的侵染力。

蜡蚧轮枝菌对茶蚜的侵染模型

接种4株蜡蚧轮枝菌Lecanicillium(Verticillium)lecanii(菌株V07、V08、V23和V27)不同剂量(2×103、2×104、2×105、2×106和2×107孢子.mL-1)孢子悬浮液到茶蚜Toxoptera aurantii室内种群,观察茶蚜种群在24℃和100%RH培养条件下的感染和发病情况,得到蜡蚧轮枝菌侵染茶蚜的发病指数,用Gompertz模型拟合了病情指数和作用时间及初始接种剂量之间的动态关系。结果表明:表观侵染速率与初始接种浓度相关,同一菌株侵染速率随初始接种孢子浓度的增大而增大。初始接种剂量为2×107孢子.mL-1时,菌株V07对烟粉虱的侵染速率最快。

蜡蚧菌和3种低浓度杀虫剂混用对大豆蚜的影响

为研究蜡蚧菌与新型生物农药混用在生物防治中的应用,本文采用PDA培养基培养蜡蚧菌BNCC336750分生孢子。采用浸渍法对大豆蚜进行毒力测定,选取最佳防治效果的108孢子/m L的孢子悬浮液浓度与亚致死浓度的化学农药35%吡虫啉悬浮剂和生物农药0.3%印楝素乳油、0.5%苦参碱水乳剂进行混配。结果表明,大豆蚜的累计校正死亡率随菌株孢子悬浮液浓度的增大而增大,当浓度为108孢子/m L时对大豆蚜毒力最高。菌药混用对大豆蚜的防治效果比单用蜡蚧菌BNCC336750孢子悬浮液或亚致死浓度生物农药的防治效果都要好。其中菌株BNCC336750孢子悬浮液与印楝素混用效果最好,处理7 d后大豆蚜累计死亡率达到94.16%。与苦参碱和吡虫啉混用7 d后大豆蚜累计死亡率分别为86.13%和80.29%。田间试验表明,印楝素混配菌株BNCC336750孢子悬浮液效果最好,7 d后防治效果达到89.47%。

蜡蚧轮枝菌对茶蚜的侵染动态

接种4株蜡蚧轮枝菌[Lecanicillium(Verticillium) lecanii]菌株V07、V08、V23和V27不同剂量(2×10~3、2×10~4、2×10~5、2×10~6和2×10~7孢子/ml)孢子悬浮液于茶蚜(Toxoptera aurantii)室内种群,观察茶蚜种群的感染流行情况,得到蜡蚧轮枝菌侵染茶蚜的发病指数。结果表明:相同初始接种剂量,菌株V07对烟粉虱的侵染速率最快;同一菌株侵染速率随初始接种孢子浓度的增大而增大。

蜡蚧轮枝菌侵染黑刺粉虱体表过程的显微观察

采用扫描电镜研究了蜡蚧轮枝菌侵染黑刺粉虱成虫的过程。结果表明:接种蜡蚧轮枝菌孢子12 h后,附着在虫体上的分生孢子萌发形成芽管,24 h后,在复眼、腹部气孔、足的基节和翅的基部等部位菌丝侵入黑刺粉虱体内,接种72 h后虫体被厚厚的菌丝层覆盖。分生孢子可以直接以芽管侵入表皮,也可以产生附着胞再侵入。分生孢子在黑刺粉虱体表萌发形成芽管,芽管顶端可形成附着胞,附着胞再形成侵入钉穿透寄主体壁。寄主体表结构影响形成附着胞的形状及穿透体壁时芽管长度。穿刺点处的小孔及附着胞周围发现粘状分泌物,为蜡蚧轮枝菌在入侵黑刺粉虱过程中穿透体壁时对寄主表皮产生降解作用的酶。

蜡蚧菌的遗传多样性及其对柑橘木虱的致病性

为探究蜡蚧菌(Lecanicillium lecanii)的遗传多样性、对柑橘木虱的致病性及其影响因素,对19个不同寄主种类和地理来源的蜡蚧菌菌株进行随机引物扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)分析,并对其ITS1-5.8SrDNA-ITS2和β-tubulin基因进行测序分析及构建系统发育树,同时测定菌株的生长速度、产孢量、孢子萌发率等生物学特性及对柑橘木虱的致病性。结果显示:蜡蚧菌种内存在丰富的遗传多样性,不同菌株的生长速度、产孢量和孢子萌发率等生物学特性及对柑橘木虱致病性均表现出明显的差异,但未发现彼此之间及其与菌株的寄主种类和地理来源之间具有相关性。在显微镜下观察菌株ZJVL-A对柑橘木虱的侵染过程发现,吸附在寄主体表的分生孢子可在接种后16h萌发入侵,42h后菌丝侵入血腔并在其中增殖,54h后可引起寄主死亡,60h后菌丝侵染并破坏寄主的内部组织器官,最后覆盖在虫体表面的菌丝又产生大量的分生孢子。本研究为进一步了解蜡蚧菌对柑橘木虱的致病机制,为开发用于柑橘木虱田间防治的生物制剂提供了依据。

蜡蚧轮枝菌代谢粗提物对烟草上烟粉虱和烟蚜的杀虫活性

测定了3株蜡蚧轮枝菌Lecanicillium lecanii的代谢粗提物(toxin_(V3450)、toxin_(Vp28)、toxin_(Vl6063))对烟草两种害虫烟粉虱Bemisia tabaci和烟蚜Myzus persicae的杀虫活性。结果表明,3株菌株的代谢粗提物对烟粉虱3龄若虫和烟蚜无翅母蚜均具有较强杀虫活性,3株菌株的代谢粗提物对烟粉虱3龄若虫的LC_(50)分别为0.11%、0.23%和0.18%;对烟蚜的LC_(50)分别为0.14%、0.35%和0.29%。表明V3450菌株的代谢粗提物对烟粉虱3龄若虫和烟蚜的杀虫活性最强,Vp28菌株的代谢粗提物toxin_(Vp28)的杀虫活性次之,Vl6063菌株的代谢粗提物toxin_(Vl6063)杀虫活性最弱。