铜绿假单胞菌LexA蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

目的克隆铜绿假单胞菌PAO1株的LexA蛋白编码区,在大肠杆菌中表达并纯化表达蛋白。方法提取铜绿假单胞菌PAO1株基因组DNA,PCR扩增LexA蛋白编码区,A-T克隆于质粒pMD 18-T载体中,阳性重组子经酶切后,回收目的片段连接至相应线性化的表达型载体pET-28a(+)中,重组质粒经测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21感受态,筛选高效表达株,表达产物经SDS-PAGE初步鉴定后,用镍珠吸附一步法纯化,表达蛋白转印PVDF膜后,经N-端测序证实。结果本研究成功克隆到PAO1株的LexA蛋白编码区并在大肠杆菌中获得表达,纯化表达蛋白经N-端测序证实确为PAO1的LexA蛋白。结论研究结果为铜绿假单胞菌PAO1株基因组中SOS盒的实验鉴定及LexA蛋白调控基因的筛选奠定了基础。

RecA激活的抗辐射菌LexA蛋白降解及其在碱性条件下的诱导降解

目的 研究在碱性条件下LexA蛋白的降解 ,观察D .radiodurans(抗辐射菌 )LexA在两种条件下的降解反应。方法 采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 ,用考马斯亮蓝R - 2 5 0染色。结果 37℃时 ,LexA蛋白在 pH7.0及pH 8.0时不发生分解反应 ;pH 9.0时完整的LexA蛋白量略有减少 ;pH 10 .0时 ,LexA蛋白大量分解 ,电泳带可见明显的蛋白片段。结论 高 pH值条件下D .radioduransLexA蛋白在 37℃发生降解。

大肠杆菌(Escherichia coli)LexA蛋白的结构与功能

LexA蛋白首先在大肠杆菌(Escherichia coli)中作为SOS反应的重要调节因子之一被发现.LexA蛋白含有202个氨基酸,由N端DNA结合结构域和C端催化核心结构域构成.细胞中LexA蛋白大都以二聚体形式存在,并且有可切割和不可切割两种构象.在正常生理条件下,LexA特异性结合16 bp的保守序列5'-CTGTN8ACAG-3',即SOS盒,抑制约50个基因的表达.当发生DNA损伤时,活化的RecA蛋白通过稳定LexA蛋白可切割构象,促进LexA蛋白Ala84-Gly85间肽键的切割,产生的C端LexA85-202和N端LexA1-84被蛋白酶ClpXP和Lon快速降解.LexA蛋白切割后,SOS基因以一定的顺序开始表达,并且完成DNA损伤修复.本文回顾和总结了LexA蛋白分子结构,自我切割分子机制和影响因素,以及在SOS反应中的作用等方面的研究进展.同时,也讨论了LexA蛋白在原核细胞中的进化保守性.

铜绿假单胞菌PAO1株基因组中2个SOS盒序列的初步鉴定

目的鉴定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1株基因组中的SOS盒序列。方法挑选铜绿假单胞菌PAO1株基因组中16个可能含有SOS盒序列的DNA片段,经PCR扩增后,用纯化的LexA表达蛋白做凝胶滞后实验;将获得的2个阳性DNA片段进一步用DNaseⅠ足纹法进行LexA蛋白结合序列即SOS盒的鉴定;分析所获得的2个SOS盒中的回文序列,以此回文序列在PAO1基因组中进行检索,初步分析出可能的SOS盒序列和可能的调控基因。结果通过DNaseⅠ足纹法初步鉴定了PAO1基因组中2个SOS盒序列,即位于基因组4 052 647～4 052 662 bp位置的CTGTCTACTTATACAG序列和5 349 888～5 349 903 bp位置的CTGTATAAATAACCAG序列,分析其回文结构为"CTG…CAG",以此回文序列在基因组中进行检索,共获得了10个候选的SOS盒序列。结论初步证实了PAO1基因组中的2个SOS盒,并获得了10条SOS盒候选序列。

大肠埃希氏菌的qnrB基因检测与耐药机制研究

目的探索本地区医院大肠埃希氏菌喹诺酮耐药基因的分布及耐药机制。方法采用PCR扩增与测序、基因初步定位、质粒接合转移实验等方法确定喹诺酮耐药的大肠埃希氏菌qnr的基因类型,以分析研究有关的耐药特点与机制。结果各大肠埃希氏菌株中仅qnrB基因阳性,qnrA、qnrS、qnrC、qnrD、qepA、aac(6’)-Ib-cr基因均阴性;并且qnrB基因包括qnrB2、qnrB5、qnrB9、qnrB16、qnrB18、qnrB19和qnrB31等位基因;在这些qnrB等位基因中,qnrB31与qnrB16、qnrB2与qnrB9同源性较高;各qnrB等位基因分别位于约21.0 kb至28.0 kb长的质粒上。结论在本地区医院存在不同的qnrB等位基因流行;实验菌株的喹诺酮耐药与qnrB等位基因结构中LexA-蛋白结合位点共有序列缺失有关。