湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6分子特征及其多克隆抗体制备

【目的】克隆湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6(3nLGR6)并制备多克隆抗体,为从肠道干细胞角度揭示湘云鲫2号的抗病机制提供技术支持。【方法】通过PCR扩增3nLGR6基因开放阅读框(ORF)序列,采用InterProScan、TMHMM Server 2.0、ExPASy Proteomics Server、SignalP 5.0、PSORTⅡPrediction、SoftBerry-Psite、SWISS-MODEL及MEGA 11.0等在线软件进行生物信息学分析;利用原核表达系统表达融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体,基于免疫组织化学分析3nLGR6在湘云鲫2号肠组织中的分布情况。【结果】3nLGR6基因ORF序列全长2874 bp,共编码957个氨基酸残基;3nLGR6蛋白理论分子量约105.4 kD,理论等电点(p I)为5.44,在其N端有1个亮氨酸重复序列结构域,C端存在1个7次跨膜结构的GPCR结构域,且在18Gly与19Ser间存在信号肽切割位点(Sec信号肽)。3nLGR6与其他硬骨鱼类的LGR6氨基酸序列高度同源,其中与二倍体斑马鱼的相似性为92.28%。与鱼类LGR6作用密切的基因有LGR4、RNF43、RSPO2、CTNNB1、APC和CTNNA1,主要涉及Wnt信号通路和Adherens junction信号通路。以纯化得到的融合蛋白3nLGR6免疫BALB/c雌性小鼠,能成功制备出小鼠抗3nLGR6多克隆抗体,且免疫组化试验结果显示该抗体可特异性识别湘云鲫2号肠道组织中的3nLGR6。【结论】3nLGR6与其他物种的LGR6氨基酸序列高度同源,其结构和功能相对较保守。制备获得的小鼠抗3nLGR6多克隆抗体能特异性识别湘云鲫2号肠道内源性3nLGR6,为后续深入研究LGR6在硬骨鱼组织中的表达情况及揭示LGR6在肠道黏膜稳态中的作用机制提供了技术支撑。

Lgr6基因质粒转染人脐带间充质干细胞对小鼠皮肤创面的修复作用

目的探讨富含亮氨酸重复序列的G-蛋白偶联受体6(Lgr6)基因与人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)构建的组织工程细胞是否更快更好地修复小鼠皮肤创面。方法体外培养hUC-MSCs,构建pIRES2-EGFP-Lgr6表达载体,将表达Lgr6的质粒转染到hUC-MSCs中,然后种植于重症联合免疫缺陷小鼠背部全层皮肤烧伤创面(实验组),同时设种植转染空载质粒的hUC-MSCs作对照组。于术后7、14、21 d观察创面愈合率,并做HE染色和免疫组织化学。结果 hUC-MSCs能正确表达Lgr6靶蛋白,术后7、14、21 d实验组创面愈合率均明显高于对照组。HE染色显示,实验组新生表皮较厚,细胞层数较多且分层较明显,皮肤附属器增多,总体创面愈合情况均较对照组好;在再生表皮和真皮层中均发现有绿色荧光蛋白标记的细胞,且部分细胞表达人源性角蛋白14。结论 Lgr6基因转导入hUC-MSCs可应用于修复小鼠皮肤创面,修复效果较好。

miRNA-513a通过负性调控LGR6抑制胃癌细胞侵袭和转移

目的:观察miR-513a对胃癌细胞体外侵袭-转移能力的影响,探讨miR-513a通过LGR6调节胃癌侵袭和转移的具体机制。方法:通过RT-qPCR方法检测胃癌组织及癌旁组织中miR-513a的表达;采用生物信息学预测miR-513a靶向调控的基因,筛选出LGR6。用Western blotting法检测胃癌组织及细胞中LGR6的表达变化,采用双荧光素酶实验分析miR-513a与LGR6的作用机制。采用Transwell侵袭实验及划痕实验检测miR-513a及LGR6干扰质粒转染后细胞体外侵袭能力及迁移能力的变化。结果:实时荧光定量PCR实验结果显示,miR-513a在胃癌组织中低表达,而LGR6在胃癌组织中高表达。双荧光素酶实验证实miR-513a可以结合在LGR6的3’-UTR区,miR-513a过表达后LGR6表达降低。同时miR-513a mimics转染后细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力均显著降低。结论:miR-513a可以在转录后水平调控LGR6的表达,从而抑制胃癌细胞的侵袭和转移。

糖蛋白激素LGR6的结构分析及其表达细胞株的建立

L GR6是新近分离出来的糖蛋白激素受体家族的新成员 ,对分离出来的全长 c DNA及其编码的蛋白质序列初步分析结果显示 ,该受体属于富含亮氨酸重复序列的 G-蛋白偶联受体。c DNA编码一个 977个氨基酸组成的多肽链 ,没有信号肽 ,跨膜区域长为 2 64个氨基酸 ,受体的胞外区域含有 16个 LRR。组织分布的研究显示 ,该受体广泛表达于人体各组织 ,但骨骼肌中没有检测到。该受体在蛋白水平上与 L GR5有 5 1%的同源性。为进一步研究受体的功能 ,我们利用脂质体 DAC-3 0转染 HEK2 93细胞 ,建立了稳定表达 L GR6的细胞株 ,用于今后的研究 ,包括天然配基的分离。

G protein-coupled receptor LGR6 is an independent risk factor for colon adenocarcinoma

LGR6 is a member of the G protein-coupled receptor family that plays a tumor-suppressive role in colon cancer. However, the relationship between LGR6 expression in patients and clinicopathological factors remains unclear. This study aimed to clarify whether the expression level of LGR6 is correlated with colon adenocarcinoma progression. Immunohistochemistry was used to detect LGR6 expression in colon adenoma tissues (n = 21), colon adenocarcinoma tissues (n = 156), and adjacent normal tissues (n = 124). The expression levels of LGR6 in colon adenoma and adenocarcinoma were significantly higher than those in normal colon epithelial tissues (P < 0.001). Low LGR6 expression predicted a short overall survival in patients with colon adenocarcinoma (log-rank test, P = 0.016). Univariate and multivariate survival analyses showed that, in addition to N and M classification, LGR6 expression served as an independent prognostic factor. Thus, low expression of LGR6 can be used as an independent prognostic parameter in patients with colon adenocarcinoma.

糖蛋白激素受体Lgr6的结构和功能

Lgr6是富含亮氨酸的G蛋白偶联受体，在人体组织中广泛分布，在胎盘、脑、心脏、肝、肺、小肠等均有表达。作为糖蛋白激素受体家族的新成员，目前尚未发现其生理性配体，故又称Lgr6为孤儿受体。研究发现，Lgr6标记的毛囊干细胞能分化成皮肤所有细胞系，参与皮肤更新及损伤修复，而且Lgr6在肿瘤组织中的表达也有重要的生物学意义。笔者对Lgr6的结构和功能进行综述。

富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体6通过Wnt/β-连环蛋白通路对结肠癌SW480细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的探讨富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体6(LGR6)对人结肠癌SW480细胞增殖和侵袭的作用及机制。方法在结肠癌细胞株SW480细胞中构建低表达LGR6的实验组、阴性对照组和空白对照组,用实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)验证LGR6 mRNA和蛋白的表达水平。用MTT法检测细胞增殖活性,用Transwell小室法检测细胞的侵袭能力,用Western Blot检测Wnt/β-连环蛋白(βcatenin)信号通路相关蛋白表达水平。结果实验组、阴性对照组和空白对照组LGR6 mRNA表达水平分别为(0.42±0.08)、(1.12±0.08)、(1.13±0.31),转染LGR6 siRNA的SW480细胞LGR6 mRNA和蛋白表达水平显著降低(均P<0.05);转染后24、48、72 h时实验组细胞增殖活性[(0.24±0.04)、(0.27±0.06)、(0.45±0.08)、(0.63±0.09)]显著低于阴性对照组[(0.22±0.03)、(0.40±0.05)、(0.92±0.07)、(1.32±0.11)]和空白对照组[(0.26±0.04)、(0.42±0.07)、(0.94±0.09)、(1.21±0.12),均P<0.05]。下调LGR6表达可促进结肠癌细胞Bax和Cleaved caspase 3蛋白的表达,并抑制结肠癌细胞βcatenin和c-Myc蛋白的表达(均P<0.05)。结论下调LGR6可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制结肠癌SW480细胞的增殖和侵袭,并促进结肠癌SW480细胞的凋亡。

人毛囊干细胞分离培养与鉴定方法的研究

目的实现毛囊干细胞的高效快速分离。方法将人头部皮肤标本显微分离毛囊隆突区组织由中性蛋白酶消化后，将其直接接种于Matrigel包被的培养板中培养。细胞迁出后，待细胞融合达到60％～70％时，传代培养。取传代培养4周的人毛囊干细胞进行流式细胞学分析及克隆形成能力测定，鉴定毛囊干细胞的表型及增殖潜能。结果分离培养所得毛囊干细胞呈铺路石样生长，细胞胞体较大，细胞核大而明显，具有较高的核质比，干细胞细胞学特征明显。流式细胞仪鉴定毛囊干细胞表面标记物Lgr5阳性率为84．02％，Lgr6阳性率为66．32％。细胞增殖能力及克隆形成能力测定结果显示，毛囊干细胞具有较强的增殖潜能，可由单细胞生成明显的克隆集落。结论本研究通过显微解剖结合消化法，实现了人头皮毛囊干细胞的高效快速分离培养。采用显微分离培养获得毛囊隆突区细胞，细胞表型分析证实其Lgr5及Lgr6阳性干细胞比率、细胞形态、细胞周期及克隆形成能力均符合干细胞特性。