单链抗体与lidamycin辅基蛋白融合蛋白工程菌的高密度发酵及其免疫活性

目的实现抗Ⅳ型胶原酶单链抗体(Fv)与lidamycin辅基蛋白(LDP)结合构成的融合蛋白Fv-LDP产生菌的高密度发酵,并测定融合蛋白Fv-LDP免疫活性。方法先在5L发酵罐中进行工程菌分批发酵和补料分批发酵,再用固定化金属亲和层析从菌体中纯化融合蛋白Fv-LDP,分步透析使之复性,酶联免疫吸附试验和免疫荧光细胞化学染色检测其免疫活性。结果确定分阶段恒速补料分批发酵为工程菌最佳高密度发酵模式,融合蛋白Fv-LDP最高表达量为4g/L,A600为55左右,培养时间约14h。融合蛋白Fv-LDP对Ⅳ型胶原酶呈阳性免疫反应,能与PG细胞特异结合。结论确定了工程菌高密度发酵工艺,融合蛋白Fv-LDP免疫活性良好,为融合蛋白Fv-LDP与lidamycin烯二炔发色团(AE)构成的小型高效化抗体药物Fv-LDP-AE的研究奠定良好基础。

单链抗体与力达霉素辅基蛋白在大肠埃希菌表达的发酵工艺

目的确定工程菌E.coli BL21(DE3)Star^(TM)/pEFL表达抗Ⅳ型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白构成的融合蛋白Fv-LDP的摇瓶发酵工艺。方法比色法测定菌体浓度,干燥失重法测定细菌干重,SDS-PAGE-Spot Denso法测定融合蛋白Fv-LDP表达量,单因素或正交设计优化发酵工艺。结果确定了融合蛋白Fv-LDP表达的最佳培养基配方和培养条件,融合蛋白Fv-LDP表达量为830μg/ml左右,比LB培养基的产量提高5.6倍。结论优化工程菌发酵工艺大大提高了融合蛋白Fv-LDP表达水平,不仅为下一步中试研究和规模化生产奠定了基础,而且为其它生物来源的抗体和抗生素组分在基因工程大肠埃希菌的生产提供了发酵方面的实验证据。

抗癌药物力达霉素的辅基蛋白对肿瘤组织细胞的结合作用

目的研究力达霉素辅基蛋白(idamycin apoprotein,LDP)对肿瘤细胞是否有结合作用,并考察这种结合作用与肿瘤有关生物学指标的相关性。方法用异硫氰酸荧光素酯(fluorescein isothiocyanate,FITC)与LDP进行偶联,以荧光显微镜观察此偶联物对临床常见肿瘤的荧光染色情况,按荧光强弱程度将着色结果分成阳性、可疑、阴性3级。以免疫组化法观察肿瘤生物学指标如ER,P53,Bcl-2表达情况,并将结果也分成阳性、可疑、阴性3级。以Kappa一致性检验和Spearman等级相关性检验判断相关性。结果仅部分乳腺癌显示阳性荧光着色:3例乳腺癌冰冻标本中,有2例显示阳性荧光着色;20例确诊的乳腺癌石蜡标本中,荧光染色显示阳性的11例,可疑的4例,阴性的5例。FITC-LDP偶联物对乳腺癌石蜡标本染色结果与ER、P53和Bcl-2的免疫组化染色结果分别经Kappa一致性检验,均有显著意义(P<0.05);与ER染色结果、P53染色结果和Bcl-2染色结果分别经Spearman等级相关性检验,分别呈负相关(P<0.05)、正相关(P<0.05)和无相关(P>0.05)。结论LDP对乳腺癌细胞存在特异的结合作用,这种结合作用与乳腺癌组织上的ER和突变型P53蛋白分别可能存在负相关性和正相关性。

基因工程重组力达霉素的制备及抗肿瘤活性

目的制备重组力达霉素rLDM,研究其抗肿瘤活性。方法构建完整力达霉素辅基蛋白表达载体pET30-sldp,并在大肠埃希菌中诱导表达重组辅基蛋白rLDP,纯化后的rLDP蛋白与力达霉素发色团AE在体外进行组装制备rLDM,MTT法检测rLDM和LDM的体外抗肿瘤活性,利用流式细胞仪检测两者对肿瘤细胞周期的影响。结果rLDP蛋白以可溶形式在大肠埃希菌中分泌表达,与发色团组装后经HPLC检测在340nm处出现特定吸收峰,表明rLDM制备成功;MTT实验结果显示rLDM和LDM对SKOV3细胞的IC_(50)值相近,无显著性差异;流式细胞仪检测结果证明两者对SKOV3细胞周期的影响趋势相似。结论大肠埃希菌表达的力达霉素辅基蛋白和发色团体外组装得到的重组力达霉素,具有和天然力达霉素相当的体外抗肿瘤活性。

两种重组菌中融合蛋白Fv-LDP含量测定方法的比较研究

目的：测定抗Ⅳ型胶原酶单链抗体Fv和力达霉素辅基蛋白LDP在大肠杆菌中表达产生的融合蛋白Fv-LDP含量。方法：3瓶培养融合蛋白Fv-LDP表达菌,固定化金属亲和层析纯化融合蛋白Fv-LDP,分步透析使之复性,HPLC测其纯度。比色法测定菌体浓度,SDS-PAGE分离蛋白带,积分密度扫描法测定融合蛋白Fv-LDP表达百分比和含量。结果：在88.7-1 064 mg·L^-1范围内,融合蛋白Fv-LDP浓度和积分密度值呈线性关系（r=0.998 8）,精密度RSD为2.09%（n=8）,平均回收率为95.18%。结论：SDS-PAGE-SpotDenso法操作简单,重复性好,灵敏度高,适用于发酵过程中对融合蛋白Fv-LDP表达产量的控制分析。

以防御素HD5为效应分子EGFR靶向融合蛋白构建及其抗胰腺癌细胞株活性研究

目的人α防御素主要由中性粒细胞(HNP1、HNP2和HNP3)和小肠潘氏细胞(HD5和HD6)分泌。HNP1-3可以被作为肿瘤标志物,小剂量的α防御素可以促进肿瘤的增长,大剂量的α防御素可以裂解杀死肿瘤细胞。制备人防御素(human defensin-5,HD5或D5)、力达霉素辅基蛋白(lidamycin apoprotein,LDP)与EGFR配体寡肽(EGFR-directing ligand peptide,Ec)组合的融合蛋白Ec-LDP-D5,并初步探讨其抗胰腺癌活性。方法采用基因工程的方法制备融合蛋白基因,并将其表达纯化得到融合蛋白Ec-LDP-D5。融合蛋白与细胞表面EGFR的亲和活性采用ELISA和细胞免疫荧光化学法;采用CCK-8法测定融合蛋白对人胰腺癌细胞PNAC-1和Aspc-1的体外杀伤活性;流式细胞术检测Ec-LDP-D5蛋白对细胞凋亡的影响。结果成功构建并表达融合蛋白Ec-LDP-D5,产物主要以包涵体的形式存在,目的蛋白经纯化、复性后,每升发酵液可以获得1mg纯度达到85%。Ec-LDP-D5可与高表达EGFR的PNAC-1和Aspc-1细胞表面结合。Ec-LDP-D5对PNAC-1和Aspc-1肿瘤细胞有强烈的杀伤作用,Ec-LDP-D5蛋白对Aspc-1肿瘤细胞抑制率为76.8%,与Ec-LDP的抑制率49.4%相比,差异有统计学意义,P=0.038;对PANC-1细胞抑制率为64.6%,与Ec-LDP的抑制率28.3%相比,差异有统计学意义,P=0.042。Ec-LDP-D5在8μmol/L的浓度下即可强烈的诱导细胞发生凋亡,细胞凋亡率(24.6±0.56)%,与Ec-LDP的凋亡率相比P=0.011。结论本实验制备的防御素融合蛋白Ec-LDP-D5可以与高表达EGFR的PNAC-1和Aspc胰腺癌细胞结合,对胰腺癌细胞具有强烈的杀伤活性和诱导凋亡能力,具有发展为抗肿瘤靶向药物的潜能。

抗血管内皮生长因子受体1和2双靶向寡肽融合蛋白A7/G6-力达霉素辅基蛋白的构建及其抗血管生成活性

目的构建抗血管内皮生长因子受体1和血管内皮生长因子受体2双靶向寡肽融合蛋白A7/G6-力达霉素辅基蛋白并研究其抗血管生成活性及作用机制。方法构建抗血管生成寡肽A7、G6与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白A7/G6-力达霉素辅基蛋白表达载体;利用亲和层析进行蛋白纯化,产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱法分析;酶联免疫吸附法和免疫细胞化学分析A7/G6-力达霉素辅基蛋白与内皮细胞的结合活性;CCK-8法检测A7/G6-力达霉素辅基蛋白对人微血管内皮细胞-1增殖的影响;蛋白质印迹法分析A7/G6-力达霉素辅基蛋白对血管内皮生长因子信号通路影响;划痕法分析A7/G6-力达霉素辅基蛋白对人微血管内皮细胞-1迁移的影响;小管形成分析A7/G6-力达霉素辅基蛋白对人微血管内皮细胞-1血管生成的影响。结果成功获得A7/G6-力达霉素辅基蛋白融合蛋白,产量20 mg.L-1培养基,纯度较高;A7/G6-力达霉素辅基蛋白具有与人微血管内皮细胞-1和人脐静脉内皮细胞结合的活性;较高浓度能够抑制人微血管内皮细胞-1的增殖;能抑制内皮细胞的迁移和体外血管生成;其作用机制是通过G6和A7抑制血管内皮生长因子信号通路中AKT蛋白的磷酸化引起的。结论针对血管内皮生长因子受体构建的双靶向寡肽融合蛋白A7/G6-力达霉素辅基蛋白具有抗血管生成的活性,为A7/G6-力达霉素辅基蛋白进一步体内活性研究和作为药物输送载体研究奠定了基础。