Identification and Biological Characteristics of Blank Spot Pathogen from Lilium lancifolium

With the increasing planting area of Lilium lancifolium, the leaf fungal dis-ease of L. lancifolium is becoming more and more serious. In June and July of 2014, the excessive rainfal leads to the serious outbreak of leaf disease of L. lanci-folium. In mid-June, the wilting rate of L. lancifolium in seriously-infected field was even up to 50%-70%. In some fields, the shoots of L. lancifolium even al wilted. The pathogen was isolated from the infected leaves of L. lancifolium. Its pathogenici-ty, spore morphology, 18S rDNA sequence and biological characteristics were stud-ied. The results showed the isolated pathogen was Alternaria alternate. The lethal temperature of mycelial growth was 55 ℃. The optimum pH was 6-7. Among the tested carbon sources and nitrogen sources, the optimum carbon source was mal-tose, and the optimum nitrogen source was yeast extract.

Isolation of LiLFY1 and Its Expression in Lily (Lilium longiflorum Thunb.)

LFY family genes play a conserved role in regulating flowering. In this study, the cDNA of LiLFY1 was isolated with the strategy of RT-PCR in combination with RACE from lily （Lilium longiflorum Thunb.）. LiLFY1 encodes a LFY transcriptional factor. The alignment analysis of the deduced LiLFY1 protein with other known LFY family proteins indicates that LiLFY1 is highly homologous with rice RFL and maize FLL. The result of Southern hybridization showed that there are two copies of LFY family genes in lily. LiLFY1 is expressed in young flower buds and shoot apical meristem （SAM） but not in roots, shoots, mature leaves, and mature floral organs. The cloned LiLFY1 gene may be applied to genetic engineering aiming for regulating the flowering time in lily.

卷丹百合黄酮提取物抗氧化活性研究

该实验旨在研究卷丹百合黄酮提取物抗氧化活性。以化学法、秀丽隐杆线虫模型为评价方法,用自由基清除率、抗氧化酶活力及线虫寿命等为指标,探究卷丹百合黄酮化合物的抗氧化能力。结果表明,卷丹百合黄酮提取物在料液比为1:10(g:mL)时,抗氧化活性达到最大值,其中DPPH自由基清除率为83.46%,ABTS阳离子自由基清除率为73.26%。卷丹百合黄酮提取物能显著提高线虫体内抗氧化酶活力和谷胱甘肽含量,提高线虫抗氧化能力,起到延长线虫寿命的作用。经过卷丹百合黄酮提取物处理的线虫在氧化应激条件下平均存活时间能达到10 h。卷丹百合黄酮提取物具有良好的抗氧化活性,具备开发食品抗氧化剂或功能食品的潜力。

卷丹百合LlARF12基因的克隆、表达及功能分析

【目的】探究卷丹百合珠芽发生前细胞和组织学层面的变化,讨论卷丹百合珠芽发生的内在机制。克隆生长素响应因子基因LlARF12,为解析LlARF12基因在卷丹百合珠芽发生过程中的作用机制提供参考。【方法】利用石蜡切片的方法对卷丹百合珠芽器官形成前的叶腋部位进行了组织学观测,从卷丹珠芽形成过程的转录组中筛选得到参与珠芽发生的关键基因LlARF12,克隆得到其编码区(CDS)序列,利用生物信息学软件对其进行分析预测,通过qRT-PCR对不同时期、不同种与品种的百合组织中的LlARF12基因进行表达模式分析,并通过VIGS技术对卷丹种球进行LlARF12基因沉默,从而验证其基因功能。【结果】克隆获得LlARF12基因长度为2346 bp,编码781个氨基酸;qRT-PCR结果显示,LlARF12在珠芽发生的小白点时期表达量显著低于未发生珠芽时期、在S1时期植株茎秆上部表达量显著低于茎秆下部、在能够自然发生珠芽的百合品种中表达量显著低于其他百合品种;沉默LlARF12基因导致卷丹珠芽发生时间提前,且发生的珠芽数量增多。【结论】在卷丹百合珠芽发生的S1时期之前,腋生分生组织已经开始启动,此处靠近表皮的薄壁细胞层数增加、细胞核堆积,并且逐渐产生成熟的维管组织。LlARF12在卷丹百合不能发生珠芽的组织部位和时期的表达量普遍更高,推测其在珠芽发生过程中可能发挥转录抑制作用,通过VIGS技术进行的基因功能验证证明了LlARF12对珠芽发生的抑制作用。

百合斑驳病毒在卷丹顶端分生组织中的分布

【目的】百合斑驳病毒(lily mottle virus,LMoV)是危害重要食药用百合卷丹的主要病毒之一,每年给百合种植业造成数十亿的损失。通过原位杂交技术明确LMoV在卷丹顶端分生组织中的分布,为百合脱毒培养提供支撑。【方法】采用种植于贵州省清镇市的栽培卷丹作为试验材料,利用RT-PCR并于NCBI网站下载不同地方LMoV分离物构建进化树鉴定卷丹所携带的病毒种类,据检测结果选取LMoV为对象,基于LMoV基因组序列设计并制备RNA荧光探针,开展卷丹茎尖和根尖石蜡切片组织的RNA原位杂交,观察卷丹茎尖和根尖中LMoV的分布。【结果】RT-PCR检测表明卷丹材料侵染了LMoV,构建进化树发现本实验分离物与吉林和辽宁的LMoV分离物关系最近,原位杂交进而表明卷丹茎尖中LMoV杂交信号主要分布在顶端分生组织下方0.15-0.2 mm的组织中,靠近紧挨分生组织叶原基的初生叶基部有较弱的病毒杂交信号,靠近初生叶的成熟叶顶端中病毒荧光信号强烈,感染LMoV的卷丹分生组织中心纵切面无毒区大小为(0.4-0.6)mm×(0.15-0.2)mm;在根尖0.25 mm×0.2 mm分生组织中无杂交信号分布,在皮层细胞中信号最强烈,在根冠和根伸长区信号较弱。【结论】卷丹顶端分生组织及最接近顶端的一个叶原基[大小约(0.4-0.6)mm×0.2 mm]未发现病毒信号,可作为茎尖脱毒的起始材料。根顶端分生组织外侧根冠有较强病毒信号,不适合作为卷丹脱毒培养的外植体。

不同植物生长调节剂对卷丹百合扦插繁殖效果的影响

本试验选取生长健壮、无病虫害的优良卷丹鳞茎为试验材料,比较不同浓度(100、300、500 mg/L)IAA、IBA、KT、6-BA处理对卷丹扦插繁殖的鳞茎发生率、繁殖系数、生根数、根长以及新生小鳞茎直径的影响。结果表明,生长调节剂种类与浓度共同影响卷丹鳞片的扦插繁殖效果,其中不同生长调节剂种类之间的影响差异更为明显。与IAA、6-BA、KT相比,IBA处理卷丹的繁殖效果较好,且以100 mg/L IBA处理效果最佳。与6-BA和KT处理相比,IAA和IBA处理卷丹鳞茎发生率较高,其中300 mg/L IBA处理的鳞茎发生率高达100%。

多因素处理诱导卷丹珠芽发芽和生根研究

为获得卷丹百合珠芽快繁的方法,探究多因素处理对卷丹珠芽发芽和生根的影响,利用多因素方差分析低温预处理、培养基质和培养温度以及三者之间的互作对卷丹珠芽发芽和生根的影响。结果表明,低温预处理与培养基质之间的互作对卷丹珠芽发芽的影响表现为极显著,对珠芽生根的影响表现为显著,且影响占比最大;培养温度对珠芽发芽和生根的影响分别表现为极显著和显著;培养基质仅对珠芽发芽的影响表现为显著;将珠芽经4℃处理14 d后置于26℃发酵锯末中培养,是诱导卷丹珠芽发芽和生根的最佳方式,培养56 d时发芽率可达98.33%,生根率可达98.89%。研究结果阐明了不同培养因素及其互作对卷丹珠芽繁殖的重要性,为卷丹珠芽的离体快繁提供了技术支持,也为珠芽在其他植物生产栽培过程中的应用提供参考。

卷丹百合生根期镉吸收转运规律初探

为了探讨卷丹百合根系对镉胁迫的生理响应,以卷丹百合为实验材料,设置不同浓度的水培试验,比较不同镉浓度处理的卷丹百合生根期根部镉吸收、转运规律,并比较根系蛋白质表达的差异。结果表明:在镉胁迫下,卷丹百合鳞茎生根期没有富集镉的特性,而卷丹百合根在20μmol/L及以上浓度情况下,富集系数大于1;转运系数分析表明,卷丹百合生根期鳞茎对镉的转运能力很弱,同时卷丹百合根系蛋白质发生了差异表达,这些蛋白功能包括与氧化活性相关的过氧化物歧化酶、与异黄酮分解相关的异黄酮还原酶、多功能调节酶核苷二磷酸激酶b。

有机肥部分替代氮肥对卷丹百合品质的影响

在典型的百合种植区,以卷丹百合为研究对象开展田间小区试验,试验设100%化肥处理(CK)、以有机肥中的氮分别替代25%(T1)、50%(T2)、75%(T3)和100%(T4)的化学氮肥5个处理,通过研究百合鳞茎产量及品质指标变化,探讨自制有机肥替代部分氮肥对百合品质的短期效应和适宜用量。结果表明:T1、T2对百合鳞茎单颗重及产量均无显著影响,而T4产量显著下降26.4%;各处理百合鳞茎中氮、钾含量无显著变化,但T2、T3处理磷含量分别显著提高21.36%和22.85%;T4处理百合鳞茎蛋白质含量显著下降16.41%,而纤维素含量显著提高16.67%;淀粉含量随替代量的增加呈先降低后升高的趋势;各处理百合维生素C含量无显著变化,T1对百合鳞茎总糖含量无显著影响,但其在T2和T3中则显著降低约18%。综合考虑产量和品质,供试有机肥替代氮肥量控制在25%以内较好。

基于抗氧化活性百合提取工艺研究

目的:研究百合抗氧化活性成分及其制备工艺。方法:采用热回流提取法制备百合提取物,以抗氧化活性为筛选指标,正交试验法优选百合提取工艺;DPPH法和羟自由基清除法评价百合提取物的抗氧化能力;比色法检测百合多糖、黄酮、多酚含量;对百合抗氧化活性与多糖、黄酮、多酚成分进行相关性分析。结果:百合抗氧化物质的最佳提取条件为溶剂20%乙醇、固液比1∶12、提取时间100 min,百合对DPPH自由基的清除率为88.2%,百合对DPPH自由基的能力与黄酮呈显著强正相关。结论:百合具有较强的抗氧化活性,主要活性成分是黄酮。

卷丹鳞茎腐烂病株及种植土壤真菌多样性研究

为探明药用百合基源植物卷丹发生鳞茎腐烂病后植株与土壤真菌群落结构的变化,解析卷丹鳞茎腐烂病的发生机制,采用分离培养方法鉴定了发生鳞茎腐烂病卷丹的可培养真菌及主要病原菌类群,利用Illumina MiSeq高通量测序技术对比分析了发病土壤与健康土壤真菌群落结构的差异。结果表明,从卷丹病鳞上分离鉴定出273株可培养真菌,其中镰刀属为优势属,这些可培养真菌中共有8属14种具有致病性。发生鳞茎腐烂病卷丹种植土壤中链格孢属(Alternaria)、葡萄孢属(Botrytis)、镰刀属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)、栓菌属(Trametes)5个病原菌属的相对丰度分别高出健康土壤0.025、0.006、0.132、0.078、0.002百分点。发病土壤真菌α-多样性高于健康土壤,β-多样性分析显示病土真菌群落结构与健康土壤存在差异。通过Lefse分析确定发病与健康土壤的特定标志物,结果显示,发病土壤的标志物包括头梗霉属(Cephaliophora)、念珠菌属(Candida)、瘤突毛壳菌(Chaetomium strumarium)等,健康土壤的标志物为油瓶霉属(Lecythophora)及其属下种。综上,卷丹种植土壤病原菌积累,真菌多样性与群落结构改变可能是鳞茎腐烂病发生的重要原因。

高海拔环境下栽培措施对藏产卷丹百合鳞茎生长特性的影响

本研究旨在建立适合我区的卷丹百合(Lilium lancifolium Thunb.)种植技术体系。选用中等带茎苗和大田种植生长4年的藏产卷丹百合鳞茎为实验材料,探究不同栽培措施对卷丹百合鳞茎生长特性的影响情况。结果说明,我区藏产卷丹百合田间试验适宜的种植密度为株距25 cm,产业推广过程中建议种植密度可以调整为株距15 cm,待出苗齐整后铺设防草布,栽培第4年且选用抹除珠芽并打顶的田间管理方式,可以提高其产量,以期能够为藏产卷丹百合在我区推广应用奠定一定的研究基础。

低温冷藏对卷丹百合珠芽呼吸强度与萌发生根的影响

【目的】探明低温冷藏对卷丹百合珠芽呼吸强度及萌发生根等指标的影响,为其产业化发展提供理论依据。【方法】采用单因素试验,研究秦岭北麓的卷丹百合珠芽在不同冷藏温度(4℃、8℃和12℃)条件下,其珠芽生长及萌根率、呼吸速率及萌发生根等指标的变化规律,筛选其破除休眠、完成春化作用的适宜冷藏温度。【结果】室温〔(25±2)℃,CK〕条件下,60 d内,卷丹百合珠芽在夏秋季处于休眠状态,其呼吸速率较小,为46~97 mg/(kg·h),不萌发。冷藏(4℃、8℃和12℃)条件下均能使卷丹百合珠芽完成春化作用并萌发生根,4℃、8℃和12℃处理整个储藏过程中卷丹百合珠芽的呼吸速率变化均呈先降后升再降趋势,分别为61~259 mg/(kg·h)、79~263 mg/(kg·h)和79~266 mg/(kg·h);其春化作用完成时间分别为55 d、50 d和40 d左右;60 d时,4℃、8℃和12℃处理的生根率分别为59.29%、55.97%和45.97%。【结论】低温冷藏可打破卷丹百合珠芽的休眠,使其完成春化。综合考虑春化完成过程及春化后珠芽的外观健康状态、生根率、活力和呼吸速率的保持等情况,以4℃冷藏55 d的处理效果最好。

卷丹百合根腐病植株与健康植株根际土壤真菌群落结构差异

【目的】揭示卷丹百合感染根腐病后根际土壤真菌群落结构、多样性变化,为进一步探明根腐病的微生态发病机理和生防菌的筛选及应用提供理论依据。【方法】分别对连作多年地块上患根腐病和健康卷丹百合根际土壤中真菌的ITS1基因进行扩增,并采用高通量测序技术进行测序,分析健康与患病百合根际土壤真菌物种组成及多样性。【结果】α多样性结果显示,卷丹百合健康与患根腐病根际土壤中的真菌群落丰富度、均匀度和多样性无显著差异。PCA分析结果显示,患根腐病百合与健康百合根际真菌群落物种组成存在差异。患根腐病与健康百合根际真菌优势菌门为子囊菌门;散囊菌纲、银耳纲、刺盾炱目、银耳目、小疱毛壳科、丛赤壳科、外瓶霉属等在患病百合根际中相对丰度显著高于健康百合。LEfSe分析结果显示,子囊菌门与Ilyonectria分别在患病与健康百合根际土壤中差异最大;Arcopilus、角菌根菌属、Ascobolus、Paraphaeosphaeria等14类菌群为健康百合根际的标志物种。【结论】连作多年地块健康百合与患根腐病百合根际真菌群落结构有明显差异。卷丹百合根腐病的发生可能与根际土壤中真菌物种结构的改变,尤其是散囊菌纲、外瓶霉属等有害真菌的增殖密切相关。卷丹百合根际土壤中存在大量潜在益生真菌,是进一步筛选根腐病生防菌的潜在资源。

不同温度处理对卷丹百合珠芽生理生化指标的影响

以卷丹百合珠芽为材料,研究其在5、10、15、20℃4种温度处理下,珠芽内部的生理指标变化以及不同温度处理对出苗情况的影响。结果表明,不同温度处理一段时间后,珠芽的组织含水量均有所下降,且温度越高下降速度越快;珠芽可溶性蛋白含量随处理时间的延长逐渐增加,5℃处理56 d后其含量高于其他处理,但不同温度处理之间无显著差异。温度对可溶性糖含量的影响较大,20℃处理下珠芽可溶性糖在前14 d有所下降,随后逐步回升;而3个低温处理下可溶性糖含量在前14 d没有明显下降,14~28 d显著上升,从28 d开始迅速下降并在42 d时到达最低值。与此同时,珠芽内的淀粉含量从14 d开始迅速上升,28 d时达到峰值,处理温度越低上升幅度越小,处理结束时5℃处理珠芽淀粉含量最低。将不同温度处理的珠芽分别在处理14、28、42和56 d后进行栽植,结果表明,5℃处理56 d的珠芽出苗速度最快,且出苗率最高(56.67%)。综上所述,利用卷丹百合珠芽进行繁殖,5℃冷藏处理56 d是最佳选择。

卷丹百合LlARR1及其在珠芽形成过程中的表达分析

【目的】克隆了卷丹百合Lilium lancifolium珠芽中LlARR1并对其进行基因表达分析,为分析LlARR1基因在卷丹珠芽形成过程中的作用机制奠定基础。【方法】通过分析珠芽形成过程的转录组数据,筛选到一个注释为ARR1的差异表达的转录本。通过PCR技术,以卷丹混合叶腋cDNA为模板克隆了ARR1的同源基因,并利用相关生物信息学软件对该基因编码的蛋白质结构进行预测;通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了LlARR1在珠芽发生发育过程中的表达模式,并探究了其对不同激素处理的响应。【结果】LlARR1的CDS全长为2148 bp,编码715个氨基酸,不存在跨膜运输结构,属于B型ARR蛋白家族。qRT-PCR结果显示,LlARR1在S0、S1时期表达趋势与转录组数据相一致。LlARR1在卷丹百合叶腋处表达量最高,且在S0时期植株茎秆上部表达量显著高于茎秆下部。同时,其在自然发生珠芽的百合品种中叶腋处的表达量显著高于自然条件下不可发生珠芽的百合品种。说明LlARR1主要在叶腋处发挥功能,并可能在卷丹珠芽发生过程中具有正调控作用。LlARR1的表达在S2(珠芽绿球期)有一个小峰值,推测其在珠芽发育过程中也发挥作用。与对照植株相比,IAA、GA3处理均显著抑制了LlARR1在S0时期的表达,但NPA处理缓解了IAA对LlARR1的抑制;GA3处理在后期的发育过程中促进其表达。推测LlARR1可能参与了生长素和赤霉素调控的珠芽发生发育途径。【结论】LlARR1表达模式分析发现,LlARR1在卷丹珠芽准备发生时期表达水平较高,且可以在叶腋处大量表达,表明LlARR1可能参与了卷丹珠芽的发生和发育,并在该过程中发挥作用。

卷丹种球分级标准研究

为了研究卷丹种球分级标准,以湖南、湖北、贵州、重庆等卷丹主产区的种球资源为材料,测定种球和籽球周径、重量、鳞茎高等指标,并将各项数据进行主成分分析、K-均值聚类分析,以周径和重量为主要分级依据,建立了卷丹种球和籽球Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分级标准,对不同等级种球和籽球进行田间种植试验。结果表明,Ⅰ级种球长势好,产量较高,Ⅲ级种球长势差,产量较低。为保证高产;卷丹生产用种球应控制在Ⅱ级以上。此方法制定的质量分级标准科学、可行,可作为卷丹种球质量控制标准,为卷丹规范化栽培提供参考。

基于UPLC-Q-TOF-MS技术鉴定卷丹百合不同部位中化学成分及其降血糖活性研究

目的 基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术鉴定卷丹百合不同部位提取物中的主要成分,并对其降血糖活性进行研究。方法 对百合中主要类型化合物的质谱裂解规律进行研究,基于质谱裂解规律结合质谱挖掘技术对卷丹百合不同部位提取物中的化学成分进行系统鉴定。并基于链脲佐菌素诱导(每天灌胃给药80 mg/kg,连续给药3天)的高血糖雄性小鼠模型[无特定病原体(SPF)昆明小鼠],通过测量小鼠的血糖、日饮水量、日采食量及体重变化情况评价卷丹百合根、茎、球茎、叶和花提取物的降血糖活性。结果 本研究阐明了卷丹百合中王百合苷类、薯蓣皂苷类、咖啡酸类、黄酮苷类和绿原酸类化合物的质谱裂解规律,构建了百合植株中化合物的挖掘方法,从卷丹百合的根、茎、球茎、叶和花中共鉴定了58个化合物,包括绿原酸类化合物6个,王百合苷类化合物14个,咖啡酸类化合物13个,黄酮苷类化合物5个,薯蓣皂苷类化合物20个。其中30个化合物首次在百合中报道。卷丹百合根及球茎提取物表现出显著的降血糖活性,使高血糖模型小鼠血糖水平从最初的23.76±1.21 mmol/L和24.29±1.35 mmol/L下降到17.21±1.23 mmol/L和18.78±1.49 mmol/L (P <0.05)。卷丹百合根及球茎提取物还能改善糖尿病引起的多饮(P <0.01)、多食(P <0.05)及体重减轻的症状。结论 本研究首次阐明卷丹百合根含有丰富的王百合苷类和薯蓣皂苷类化合物,并具有显著的降血糖活性,为百合植株的综合利用及降血糖药物的开发奠定基础。

土壤镉污染对卷丹百合生长和镉分布的影响

为探究卷丹百合对镉污染的响应,开展不同镉浓度梯度(2.5、3、3.5、4 mg·kg^(-1))的盆栽试验,研究了不同浓度镉污染卷丹百合种球萌发、生长速率、生物量积累、生理响应和各器官镉含量的影响,分析了镉分布规律及各器官镉含量与土壤镉浓度的关系。结果表明:(1)C4(4 mg·kg^(-1))镉浓度显著降低卷丹百合发芽率、发芽势、生长速率,C2(3 mg·kg^(-1))、C3(3.5 mg·kg^(-1))镉浓度分别增加了百合鳞茎生物量的13.84%和38.96%。(2)随土壤镉浓度增加,丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性呈先升后降再升趋势,过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性随镉浓度的增加呈先增后降趋势,C4浓度对SOD、CAT和POD具有抑制作用,对MDA的含量有促进作用。(3)各器官镉含量随土壤镉浓度的增加而增加,同一镉污染下,镉分布规律为地上茎>叶>花>根>鳞茎;与对照相比,各器官镉富集系数均显著下降,地下部转运系数显著上升,而地上部各器官转运系数呈下降趋势。(4)土壤镉含量与卷丹百合各器官都具有极显著正相关性,且土壤镉与鳞茎镉含量的相关性最高。综上所述,卷丹百合耐镉性能较好;卷丹百合通过调节生理特性、生物量以及镉富集和转运能力等方式来降低土壤镉污染的危害;鉴于土壤与鳞茎镉含量具有最高的正相关性,控制土壤镉浓度是降低鳞茎镉含量,保证安全生产的重要措施。

卷丹百合组培技术研究

以卷丹百合鳞片为外植体,通过调节不同激素的质量浓度,确定卷丹百合组织培养快繁体系。结果表明:用卷丹百合的内部鳞片作为外植体感染率最低,诱导培养基配方为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L;增殖培养基配方为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L;生根培养基配方为:1/2MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖60 g/L+琼脂7 g/L,为日后生理抗性研究及分子研究提供前期基础。