阳离子脂质体Lipofectamine2000对人胰腺癌Capan-2细胞的毒性作用

目的探讨阳离子脂质体Lipofectamine2000(Lipo)在一定浓度下对细胞毒性的作用机制。方法应用一定毒性浓度的Lipo作用于胰腺癌Capan-2细胞,利用细胞直接记数法和流式细胞术检测其对Capan-2细胞生长、细胞凋亡和周期的影响。结果Lipo与siRNA的浓度均影响转染率的高低。在2ml转染体积中,Lipo在5μl的浓度下,使Capan-2细胞生长明显减慢,以第3天后更加明显(P<0.001)。随着转染细胞按常规培养的时间延长,早期凋亡细胞明显增多(P<0.05),活性细胞明显减少(P<0.01),而损伤细胞和死亡细胞明显增多(P<0.001),以48h后更明显;G0～G1期细胞明显增多(P<0.05),G2-M期细胞明显减少(P<0.01),S期细胞明显减少(P<0.01),晚期凋亡细胞减少(P<0.05)。结论在一定浓度下,Lipo可影响细胞的生长、早期凋亡和细胞周期分布,因此,利用Lipo在不同的细胞系进行基因转染过程中Lipo应进行浓度梯度筛选。

电穿孔与脂质体lipofectamine转染miR-218进入肝癌细胞效率的比较

目的:比较采用电穿孔和脂质体lipofectamine两种方法转染人肝癌细胞的效率优劣。方法:分别采用电穿孔和脂质体转染miR-218进入人肝癌细胞Hep G2,采用RT-PCR、Western blot、流式细胞仪、Tunel检测等方法比较两种方法的转染后对人肝癌细胞的影响。结果:采用两种方法都可以成功将miR-218转染进人肝癌细胞Hep G2中,降低了Hep G2中miR-218靶基因RNA编辑酶ADAR1的表达,使得细胞凋亡增加,但电穿孔转染组效率更高。结论:电穿孔转染是一种安全、高效的转染方法,值得推广。

Dosper和Lipofectamine转染特点的比较

目的 探讨Dosper和Lipofectamine两种脂质体转染载体的特点 ,为广泛应用打下基础。方法 将新构建载体分别用Dosper和Lipofectamine在有血清和无血清情况下转染包装细胞PA 3 17,通过NIH 3T3细胞检测各组病毒滴度。结果 在无血清组 ,Lipofectamine转染效率略高于Dosper ,但两者无显著性差异 (P >0 .0 5) ;在有血清组 ,Dosper组转染率显著高于Lipofectamine(P <0 .0 1)。两者在有血清组的转染率均低于无血清组。结论 在无血清存在下 ,Dosper和Lipofectamine转染效率都

LipofectAMINE2000与Fugene6转染细胞的效率比较

目的:比较LipofectAMINE2000与Fugene6转染细胞的效果。方法:将含有Firefly和Renilla荧光素酶基因的质粒分别用LipofectAMINE2000和Fugene6转染293T、HepG2和DLD-1细胞,于48h后裂解细胞测定荧光素酶活性。结果:在293T细胞中,LipofectAMINE2000转染组的萤火虫(Firefly)和Renilla荧光素酶活性分别是Fugene6转染组的6.5和5.6倍(P<0.005);在HepG2细胞中,LipofectAMINE2000转染组的Firefly和Renilla荧光素酶活性分别是Fugene6转染组的44和49倍(P<0.001);而在DLD-1细胞中,两者无差别。结论:转染试剂LipofectAMINE2000和Fugene6对不同细胞的转染效果存在差异,当进行转染实验时,对于不同的细胞须根据情况进行选择。

阳离子脂质体Lipofectamine2000对PC12细胞转染效率的研究

通过改变转染试剂及DNA用量和转染时间等影响转染效率的重要因素来实现阳离子脂质体lipofectamineTM2000(lipo2000)对PC12细胞的高效转染。结果表明,lipo2000转染PC12细胞的最佳转染条件:lipo2000用量为5μL,DNA 2μg,转染时间为6 h,这种条件下的PC12细胞转染率高达40%,且未影响细胞的正常分泌,这为应用PC12细胞进行神经生物学研究提供了基础资料。

Lipofectamine 2000介导重组siRNA质粒载体转染SGC7901的条件优化

目的寻求Lipofectamine 2000介导外源基因体外转染胃癌细胞SCG7901的最佳条件,建立有效的转染体系。方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,统计分析在不同质粒与脂质体的用量比、培养基选择、转染作用时间等条件下脂质体介导外源基因导入胃癌细胞的效率。结果用24孔板培养细胞时,在细胞融合度约90%,质粒用量为0.6μg,脂质体用量1.2μl(两者质量/体积比为1:2),转染作用时间为8 h时,转染效率为465%%,细胞存活率约78%。结论按以上转染体系,可获得较为满意的结果。

提高Lipofectamine2000对PC12细胞转染效率的研究

目的探讨提高PC12细胞转染效率的方法。方法细胞培养板用10μg/mLⅠ型牛胶原蛋白包被,通过在转染过程中加入9μmol/L趋溶酶体试剂氯喹及8μmol/L聚胺类试剂亚精胺,同时调整Lipofectamine2000与DNA用量的比例和转染时间。考察DNA与Lipofectamine2000的比例对PC12细胞转染效率的影响,转染时间对PC12细胞转染效率的影响,氯喹、亚精胺用量对PC12细胞转染效率的影响,氯喹、亚精胺对PC12细胞活性的影响,氯喹、亚精胺对PC12细胞神经轴突生长的影响及与4种常用脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率的比较。结果①对PC12细胞转染,DNA∶Lipofectamine2000用量比例应控制在1∶4。②当转染时间分别为1、2、4、8、24 h时,PC12细胞转染率分别为35.5%、37.9%、40.5%、40.3%及38.6%,4 h达到最大转染效率。③氯喹、亚精胺加入浓度的增加,PC12细胞转染效率随之增加,当氯喹、亚精胺加入终浓度分别增至9μmol/L和8μmol/L时,PC12细胞的转染效率最高,转染效率为40.5%。④加入终浓度为9μmol/L氯喹与8μmol/L亚精胺前、后MTT试验吸光度(590 nm)分别为(0.466±0.042)与(0.451±0.038),差异无统计学意义(P>0.05),对PC12细胞的活性无影响。⑤加入氯喹、亚精胺前、后,PC12细胞的神经轴突生长数量与长度差异无统计学意义(P>0.05)。⑥FuGENE、PolyJet、Lipofectamine LTX and Plus、Lipofectamine2000 4种脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率分别为10.5%、8.6%、11.8%及15.3%,本法PC12细胞转染率为40.5%,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论加入氯喹及亚精胺,实现阳离子脂质体Lipofectamine2000对PC12细胞的高效转染,为PC12细胞进行神经细胞基因功能及开发遗传病治疗方案等生物学研究提供了一种安全、廉价的新方法。

载脂蛋白E修饰的Lipofectamine 2000靶向转染HepG2细胞的实验研究

目的制备载脂蛋白E(ApoE)修饰的Lipofectamine 2000作为基因运载体,并研究其对肝癌HepG2细胞的靶向性和毒性作用。方法构建ApoE修饰Lipofectamine 2000运载体,通过DNA包裹实验检测脂质体与DNA结合的能力,分析脂质体包裹DNA的结合比。脂质体包裹p Genesil-1质粒转染HepG2细胞,通过荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效率。MTT实验研究脂质体对HepG2细胞的毒性作用。采用t检验进行两两数据之间的比较,实验数据以均数±标准差(sx±)表示,P<0.05为差异具有统计学意义。结果成功制备了ApoE修饰的Lipofectamine 2000运载体,DNA包裹实验显示质粒与Lipofectamine 2000和Apo E修饰的Lipofectamine 2000的质量体积比分别为1∶2、1∶2.5时,可完全包裹质粒;Lipofectamine 2000和Apo E修饰的Lipofectamine 2000转染Hep G2细胞的转染效率分别为(20.35±0.50)%、(30.65±0.49)%,ApoE修饰的Lipofectamine2000对Hep G2细胞的转染效率明显高于Lipofectamine 2000,转染效率差异有统计学意义(P=0.001);MTT实验表明Apo E修饰后的Lipofectamine 2000没有增加Lipofectamine 2000对HepG2细胞的毒性作用(P>0.05)。结论通过Apo E对Lipofectamine 2000进行修饰,提高了HepG2细胞对质粒的摄取,成功构建了一种高效的肝癌靶向基因治疗运输载体。

阳离子脂质体转染Hela细胞的实验

背景:基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体。目的:评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件。设计、时间及地点:以Hela细胞为观察对象,分组设计。实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委-教育部重点实验室完成。材料:质粒pGFP-N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存。方法:首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性。主要观察指标:采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因(绿色荧光蛋白基因pGFP-N2),分析阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性。结果:Lipofectamine2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine2000转染率较高;当Lipofectamine2000与DNA质量比为3∶1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine2000的毒性相对较小。结论:对Hela细胞而言,Lipofectamine2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性。

脂质体载体法转染成纤维细胞的最佳条件

目前基因转染的方法有多种，其中磷酸钙ＤＮＡ沉淀法应用较为广泛，但其转化效率不高，且不太适用于悬浮细胞和原代细胞培养的上皮细胞的转化〔１〕。本文介绍的Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ是一种新的多阴离子转染脂质体，其独特的精胺基团强负电子头部可自发地与ＤＮＡ...

新生大鼠螺旋神经节细胞体外生长特点及脂质体介导的转染效率

目的探讨螺旋神经节细胞（spiral ganglion cells,SGCs）体外生长规律及特点,并观察阳离子脂质体转染SGCs的情况。方法从出生3~4 d的SD大鼠耳蜗中分离螺旋神经节组织,消化后放在含10%胎牛血清的DMEM/F12中培养,第2 d换用含2%B27及5μmol/L阿糖胞苷的Neurobasal培养基纯化SGCs,取第4 d活性良好的细胞爬片后,通过免疫荧光法用NF-200抗体鉴定SGCs;另外用质粒pEGFP-C2联合Lipofectamine 2000转染SGCs,观察其转染效率及对细胞活性的影响。结果体外培养的SGCs胞体饱满透亮,折光性好,一般能存活2周左右,第3~7 d活性最好。细胞对NF-200染色阳性;约10%的SGCs能被Lipofectamine 2000转染,但小部分细胞轴突缩短,甚至漂浮起来。结论含B27的Neurobasal培养基能培养出活性良好的SGCs;脂质体和质粒pEGFP-C2能成功地转染SGCs,但转染效率较低,并在一定程度上影响细胞的活性。

人β-NGF重组质粒转染GFP转基因小鼠BMSC的实验研究

目的观察携带有人β神经生长因子(β-NGF)重组质粒的骨髓基质干细胞(BMSC)的生物学特性。方法培养小鼠BMSC,采用脂质体LipofectamineTM2000(Lip2000)转染方法将含有人β-NGF基因的重组质粒转染至含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的小鼠BMSC中,利用酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法检测其β-NGF蛋白的表达水平。结果采用脂质体Lip2000转染方法能成功地将β-NGF重组质粒转染至BMSC,转染后细胞出现β-NGF基因的表达,并且其表达的β-NGF蛋白能有效地保护转染过程中对细胞的损害。结论经转染后携带β-NGF基因质粒的小鼠BMSC仍有增殖、分化能力,并且具有了β-NGF蛋白的表达能力。

大鼠胚胎原代海马神经元两种转染方法的比较

目的:原代海马神经元是原代细胞中比较难转染的细胞,为了得到比较高的转染效率,通过比较Li-pofectamine2000转染法和大鼠神经元核电转法(rat neuron nucleofector kit)转染效率及转染前后细胞的存活率,来探讨Nucleofector Kit核电转法的高效性。方法:选取胚胎18 d(E18)大鼠的海马神经元进行原代培养,获取海马神经元单细胞悬液后,于种植前和种植24 h后分别采用Nucleofector Kit和Lipofectamine 2000转染红色荧光蛋白(red fluorescence protein,DsRed)质粒。神经元转染48 h后分别采用轴突标记物Tau-1进行免疫荧光染色鉴定神经元。神经元的存活率采用台盼兰进行检测。结果:Lipofectamine2000的基因转染率仅为5.34%,而大鼠神经元Nucleofector Kit的转染率为44.54%,后者为前者的8.34倍。Lipofectamine2000转染细胞前后的存活率分别为98.56%和91.44%,而Nucleofector Kit组分别为98.26%和74.02%。结论:大鼠神经元核电转法能高效稳定的转染原代海马神经元。

T-STAR基因对结肠癌细胞系HCT-116端粒酶活性的影响

目的:通过正、反义T-STAR(testis—signaltransduc—tionandactivatorofRNA)基因转染结肠癌HCT-116细胞,观察对细胞端粒酶活性的影响.方法:用脂质体Lipofectamine法将正、反义T-STAR基因转染入HCT-116细胞,用RT—PCR及Westernblot方法检测该细胞T—STAR基因mRNA和蛋白表达变化,并用PCR—ELISA法检测细胞端粒酶活性改变.结果:在T—STAR转染的结肠癌HCT-116细胞中,T—STARmRNA和蛋白表达显著增加(分别为296%,180%,P<0.01),端粒酶活性明显升高;而在反义T—STAR转染的细胞中,T—STARmRNA和蛋白表达显著下降(分别为59%,83.8%,P<0.01),端粒酶活性明显降低.转染空白载体和未转染细胞中T—STAR表达极端粒酶活性无显著性差异.结论:结肠癌HCT-116细胞T—STAR基因可能参与细胞端粒酶活性的正相调节.

293T细胞对介孔二氧化硅纳米材料的摄取研究

目的:研究在脂质体Lipofectamine 2000的介导下,293T细胞对介孔二氧化硅纳米材料(mesoporous silica nanomaterials,MSNs)的摄取变化。方法 :制备和表征MSNs;293T细胞分别与100μg/mL MSNs、MSNs+Lipofectamine2000共孵育,通过透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察及定量分析293T细胞对材料的摄取。结果:TEM、X线衍射及氮气吸附-脱附分析表明,制备的MSNs结构规则、分散性好,尺寸在100 nm左右;TEM定量结果发现,Lipofectamine 2000显著提高了293T细胞对MSNs的摄取,P<0.001。结论:Lipofectamine 2000能提高293T细胞对MSNs的摄取,为MSNs在293T细胞内的生物应用创造了条件。

利于树突棘形态学观察的原代海马神经元转染方法的优化

目的:为有助于观察树突棘的变化,探索出较为理想的原代大鼠海马神经元转染方法。方法:应用Lipofectamine2000和慢病毒2种转染方法对体外培养8d的SD胎鼠海马神经元进行绿色荧光蛋白(GFP)质粒转染,观察海马神经元转染效率和荧光表达情况,并用台盼蓝染色检测神经元的存活率;采用优选出的转染方法对体外培养8d的海马神经元进行转染,观察转染后培养至10、15、20d和25d不同时间海马神经元树突棘的生长发育情况;观察8、12d和16d不同时间转染对海马神经元树突棘形态学观察的影响。结果:对于树突棘形态学观察而言,Lipofectamine 2000转染效果显得更为优越;海马神经元培养至20d时,树突棘发育较成熟;12d时转染是进行树突棘形态学观察转染的最佳时间。结论:用Lipofectamine 2000转染GFP方法对培养12d的神经元进行转染,培养至20d时树突棘形态学观察效果良好。

RNA干扰致基因表达沉默细胞模型的建立

目的探讨siRNA和shRNA在基因功能研究中的应用。方法用化学方法合成siRNA,以及用常规的分子克隆方法构建shRNA表达载体。以人类K562细胞为实验对象,采用lipofectamine将MDM2基因的siRNA和shRAN表达载体导入细胞后,用多重RT鄄PCR和Westernblot检测目标基因MDM2的表达水平。结果K562细胞瞬时转染MDM2siRNA48h后,MDM2蛋白质表达下降超过60%;稳定转染shRNA表达载体后,MDM2基因在mRNA和蛋白质表达水平下降超过70%。实验结果表明成功地建立了MDM2表达下调的实验细胞模型。结论siRNA和shRNA都能有效地导致目标基因表达沉默,在基因功能研究中瞬时转染和稳定转染需要配合使用以获得更理想的实验结果。

UL27基因shRNA表达载体对293细胞转染效率的优化

旨在优化Lipofectamine2000试剂介导UL27基因重组质粒p GPU6/GFP/Neo-UL27shRNA转染HEK293细胞的条件,为研究UL27基因重组质粒对HSV-2的干扰作用奠定基础。用Lipofectamine2000试剂介导p GPU6/GFP/Neo-UL27shRNA重组质粒转染293细胞,采用流式细胞仪检测不同的转染时间下的转染效率,同时荧光显微镜和流式细胞仪检测不同比例条件下的转染效率,MTT法检测细胞的存活率。在质粒与转染试剂复合物的配比为0.8μg∶2μL,转染48 h,转染效率最高并且对细胞毒性最小。优化p GPU6/GFP/Neo-UL27shRNA转染293细胞的条件,提高了转染效率。

二乙酰去水卫矛醇联合野生型p53基因诱导肝癌BEL-7404细胞凋亡的作用

目的 实验通过转染野生型p53基因与应用二乙酰去水卫矛醇(1，2：5，6-Dianhydro-3，4-diacetylgalactitol，DADAG)联合作用于肝癌BEL-7404细胞，来研究p53基因联合二乙酰去水卫矛醇诱导肝癌BEL-7404细胞的凋亡作用。方法野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌BEL-7404细胞，同时加入DADAG作用。96h后，用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果流式细胞仪分析细胞凋亡结果：阴性对照组为1．6％、转染pUHD10-3组为3．9％、用DADAG处理组为29.4％、转染pUHD10-3-p53组为35.3％、转染p53基因及用DADAG处理组为59．8％。结论野生型p53基因与DADAG均可诱导人肝癌BEL-7404细胞发生凋亡，转染野生型p53基因与DADAG联合作用，有促进肝癌BEL-7404细胞凋亡的作用。

脂质体介导人β-神经生长因子基因转染培养肌母细胞的表达研究

目的 了解含 β-神经生长因子 (β- NGF)基因的表达质粒 PSVCEP NGF- CAT在培养肌母细胞中的表达及 L ipofect AMINE阳离子脂质体介导的转染效率。方法 将表达质粒 PSVCEP NGF- CAT经 L ipofectAMINE转染至培养成的肌母细胞中 ,用免疫细胞化学方法检测基因在肌母细胞内的表达。结果 培养肌母细胞在转染 6小时吞噬脂质体最显著 ,转染 48小时后约 40 %的肌母细胞胞质内有β- NGF基因表达。结论 含β- NGF基因的表达质粒 PSVCEP NGF- CAT可以在培养肌母细胞中表达 ,脂质体转染的方法简便。