不同转染试剂转染绵羊成纤维细胞效果比较

为了确定GDF-8基因干扰质粒转染绵羊成纤维细胞的最佳转染条件,采用LipofectamineTM2000与FuGene HD这2种转染试剂介导质粒转染绵羊成纤维细胞。结果表明,LipofectamineTM 2000介导转染时,当DNA用量为0.4μg,LipofectamineTM 2000用量为1.0μL,转染时间为6 h时,能达到最佳转染效果;FuGeneHD介导转染时,当每100μL转染液内含有质粒DNA 2μg,FuGene HD 10μL,每孔加入转染液5μL时,可获得最佳转染效果。FuGene HD的转染效率显著高于LipofectamineTM2000转染效率。

磁性纳米颗粒与脂质体介导REST-siRNA转染hADSCs的比较

目的对聚乙烯亚胺包被的磁纳米颗粒(PEI-SPIO)与脂质体(lipofectamineTM2000)作为基因载体转染人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的可行性及转染后细胞的增殖、转染效率及基因瞬时干扰效率进行比较分析。方法分别将PEI-SPIO和lipofectamineTM2000作为基因载体连接REST-siRNA体外转染hADSCs,用MTT法检测hADSCs增殖和功能;用荧光显微镜观察转染效率;分别用Real-time PCR和Western blot检测REST的表达。结果用磁性纳米颗粒和脂质体作为基因载体转染细胞后,细胞成活率分别为99%和79%(P<0.05);磁纳米颗粒和脂质体的转染效率无差异,分别为75%和71%;磁纳米颗粒和脂质体作为基因载体时RNA表达量分别为(0.46±0.04)和(0.53±0.05),蛋白水平表达量分别为(0.501±0.006)和(0.523±0.004)。结论磁性纳米颗粒因其具有低细胞毒性可代替脂质体作为转染干细胞的基因载体。

稳定表达TMEM16A蛋白TE-1细胞株的构建与鉴定

目的建立稳定表达TMEM16A蛋白的TE-1肿瘤细胞株。方法用Lipofectamine 2000转染试剂将TMEM16A基因转染到TE-1细胞,经G418筛选,使用激光共聚焦显微镜和Western blot技术检测TMEM16A基因是否在TE-1细胞中已经稳定表达。结果通过使用G418进行筛选,阳性克隆于4周后培养形成。激光共聚焦显微镜观察稳定表达TMEM16A蛋白的TE-1细胞可见细胞发出绿色荧光。Western blot结果表明,未稳转细胞和稳转细胞系统均表达有TMEM16A蛋白,而稳转细胞系统的蛋白水平明显高于未转染细胞系统的蛋白水平。结论利用脂质体转染方法成功构建了稳定表达TMEM16A基因的TE-1细胞系。

不同浓度miR-155mimics和miR-155 inihibitor在足细胞中的转染效果

目的探讨瞬时转染miR-155mimics和miR-155 inihibitor化学合成物在足细胞中表达变化及其稳定情况。方法体外培养小鼠肾小球足细胞,用脂质体法将miR-155mimics/NC、miR-155 inihibitor/NC、Cy3 miR-155 mimics/inhibitor NC转染足细胞,构建足细胞内miR-155高表达模型、低表达模型、荧光基团。然后用免疫荧光显微镜观察不同剂量LipofectamineTM 2000转染不同浓度Cy3 miR-155 NC后的荧光转染效果。用实时荧光定量PCR技术检测足细胞中miR-155mimics浓度梯度(50、80、100 nmol/mL)、miR-155 inihibitor浓度梯度(80、100、150 nmol/mL)的miRNA-155表达。结果达到一定剂量的LipofectamineTM 2000足以饱和不同浓度的miRNA,并将不同浓度Cy3 miR-155 NC成功转入足细胞内,且转染效率达80%以上。qRT-PCR结果显示转染miR-155mimics、miR-155 inihibitor 24 h后,miR-155在足细胞中的表达明显改变,与阴性对照组(NC)比较差异有统计学意义,表明转染成功。转染80 nmol/mL浓度的miR-155mimics,miR-155在足细胞中的表达明显上调(P<0.001),与其他浓度对比表达量升高,差异有统计学意义。转染150 nmol/mL浓度的miR-155 inihibitor,miR-155在足细胞中的表达明显下调(P<0.001),与其他浓度对比表达量降低,差异有统计学意义。结论 LipofectamineTM 2000达到适当剂量时将各工作浓度的miRNA-155转入足细胞内的转染效果高。80 nmol/mL的miR-155mimics和150 nmol/mL的miR-155 inhibitor可能较适合用于实验研究。

Rac1b小干扰RNA对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响

目的观察Rac1b小干扰RNA(Si-Rac1b)对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法 Si-Rac1b在lipofectamineTM2000介导下转染筛选出的Rac1b高表达的结直肠癌细胞SW1116,分别从RNA和蛋白水平检测转染细胞Rac1b的表达,采用细胞增殖实验,损伤刮擦实验,体外侵袭实验(Trans well小室)和hoechst方法分别检测Si-Rac1b转染细胞的增殖潜力,迁移与侵袭能力和凋亡的变化。结果成功转染Si-Rac1b的肿瘤细胞,Rac1b mRNA和蛋白表达都明显下调,而Rac1 mRNA和蛋白表达无明显变化;Si-Rac1b可明显抑制结直肠癌细胞SW1116的增殖、迁移和侵袭均并能促进SW1116细胞的凋亡。结论 Si-Rac1b能够部分逆转结直肠癌细胞SW1116的恶性生物学行为。