飞蝗内表皮蛋白基因LmAbd-5的表达与功能分析

【目的】基于飞蝗(Locusta migratoria)转录组数据库获得内表皮蛋白(endocuticle structural glycoprotein)基因Lm Abd-5的c DNA序列,分析该基因的序列特征和m RNA表达特性,采用RNAi方法分析其生物学功能,探讨其在飞蝗表皮形成中的作用,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库,获得Lm Abd-5 c DNA全长序列并克隆验证;采用Signal P在线软件分析蛋白的信号肽,利用SMART网站预测其功能域,使用MEGA 7.0软件中neighbor-joining(NJ)方法,与其他昆虫同源序列进行聚类分析;采用reverse-transcription quantitative PCR(RT-q PCR)方法检测Lm Abd-5在飞蝗5龄第2天若虫不同组织部位和5龄不同发育时期体壁组织中的表达情况,揭示其组织和时期表达模式;采用RNA干扰(RNAi)技术及透射电镜技术(TEM)观察沉默Lm Abd-5后对飞蝗生长发育和表皮结构的影响。【结果】通过搜索得到Lm Abd-5 c DNA全长序列并进行了克隆和测序验证,获得520 bp全长c DNA序列,其中ORF为303 bp;基因结构分析显示该基因含有3个外显子;功能域分析发现其含有1个信号肽和1个几丁质结合域(chitin binding domain 4,Cht BD4),与沙漠蝗、白蚁、赤拟谷盗等的Abd-5结构类似;BLAST分析结果表明Abd-5在昆虫中高度保守,飞蝗与沙漠蝗Abd-5序列一致度高达81%;对其保守基序进行Web Logo分析发现Lm Abd-5属于表皮蛋白CPR家族中的RR-1亚类;聚类分析结果显示,Lm Abd-5与沙漠蝗和白蚁的Abd-5显示出较近的亲缘关系;RT-q PCR结果显示Lm Abd-5在前肠、后肠、气管和体壁等由外胚层形成的组织中高表达,而在胃盲囊、中肠、马氏管、脂肪体和翅芽中低表达或不表达;不同时期表达分析发现,Lm Abd-5在4龄若虫蜕皮后0—72 h(5龄早期)具有高表达,其中蜕皮后72 h时达到最大表达量,随后表达量急剧降低(96—168 h),其表达时期与内表皮形成时间一致;采用RNAi技术分析该基因的生物学功能,对5龄第2天若虫分别注射等量的ds Lm Abd-5和ds GFP(对照),发现注射ds Lm Abd-5的5龄若虫和对照组相同,均可正常蜕皮,发育至成虫第2天目的基因表达量显著降低,但未出现肉眼可见的异常表型。分别取成虫第2天处理组和对照组成虫表皮进行超微结构观察,发现与对照组相比,处理组成虫内表皮片层结构较为疏松,导致内表皮片层变厚,最终表现为整个内表皮变厚。【结论】根据转录组数据库分析获得1个CPR家族表皮蛋白Lm Abd-5,该蛋白含有1个信号肽和1个几丁质结合域Cht BD4,属于RR-1亚类;Lm Abd-5主要在外胚层起源的组织中高表达,沉默Lm Abd-5后飞蝗没有肉眼可见的表型,但超微结构分析发现其参与飞蝗内表皮片层结构的形成。