淡水鱼类线粒体DNA D-loop基因的引物设计和应用

线粒体DNA测序已广泛应用于鉴定和区分种类以及解决系统进化关系问题。本文选取已测定的主要淡水鱼类的线粒体DNA D-loop基因序列进行同源性比较,寻找保守序列,利用简并性原则设计一对通用的简并引物。利用设计的引物对广东省珠江流域主要的淡水鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因进行扩增,均能获得单一的目的DNA片断,特异性扩增产物大小为1 kb左右。经测序及与GenBank同源序列的比较,证实为包含线粒体控制区全序列的扩增产物。本研究所设计的引物和应用的方法可以快速地同时对多种鱼类进行大规模的遗传背景分析,鉴定某些难于鉴别的近缘物种,为我国鱼类的种类鉴定、地理种群鉴别及种质资源的评估提供重要的工具。

棉花miRNA表达量检测方法Stem-loop RT-PCR的建立

为建立一套鉴定棉花miRNA表达丰度的分子技术,优化了Stem-loop RT-PCR方法,并通过分析棉花3个miRNA的表达谱来评价分析该技术体系的特性。首先设计3条引物(茎环特异性反转录引物、正向引物和通用反向引物),通过cDNA和RNA梯度稀释,分析引物的扩增效率和检测灵敏度。结果表明,Stem-loop RT-PCR方法中设计的引物具有较高的扩增效率和检测灵敏度,miR156和miR159扩增效率分别为102.0%和103.6%;并对不同miRNA分析其总RNA检测灵敏度,miR156和miR159的总RNA检测灵敏度差异较大,分别为20 ng和2 pg。同时,应用建立的棉花Stem-loop RT-PCR方法,成功地分析了Gh-miR156、Gh-miR159和Gh-miR5658在根茎叶中的表达量。由此可见,棉花Stem-loop RT-PCR方法具有灵敏度高、特异性强、成本较低和适用于一般实验室等优点,为棉花等植物miRNA相关研究提供了技术保证,加快了miRNA及其调控基因功能的研究步伐。

加环引物LAMP法快速检测沙门氏菌方法的研究

探讨了加环引物对LAMP的影响,并与普通PCR法进行了比较,建立一套快速检测沙门氏菌的新方法.以沙门氏菌的inva基因为靶基因,选择PCR的特异性引物,并基于该基因设计出LAMP反应的引物;该研究对LAMP体系的反应温度、dNTP浓度和镁离子浓度等扩增条件也进行了优化,并检测了PCR和LAMP的引物特异性,比较了PCR法、LAMP法和加环引物的LAMP法的灵敏度.结果表明:普通PCR法检测的灵敏度为2.28×103cfu/ml,未加环引物的LAMP法的灵敏度为2.28×101cfu/ml,加环引物的LAMP法的灵敏度为2.28×100cfu/ml.通过三种方法的比较可知:LAMP法检测沙门氏菌比PCR法更加快速、灵敏,而加环引物可进一步提高LAMP的扩增效率.本研究为快速检测沙门氏菌方法的构建奠定了基础,并认为LAMP在检测微生物方面有着广泛的发展前景.

基于实时荧光定量反转录PCR技术的动物miRNA表达分析策略

在人体内有约60%的蛋白质编码基因受到到miRNA调控。近年来,miRNA参与调控的与动物生长相关的细胞周期、发育、分化和新陈代谢等多种生物学过程也越来越受到关注。目前针对miRNA表达检测的常用方法有很多,其中基于反转录PCR(RT-PCR)的放大检测技术是应用范围最广,实施手段最灵活的一种研究策略。主要包括miRNA的全定量PCR法(miR-Q)、基于茎环引物的实时荧光定量PCR法、Poly(A)加尾性通用反转录法、miRNA表达谱的高通量RT-PCR分析和miRNA扩增谱系(mRAP)法。作者对这几种基于实时荧光定量RT-PCR技术的动物miRNA表达分析策略分别进行了介绍,对其原理、方法和应用范畴进行了概括性总结。

一种用于检测恶性疟原虫的双环引物环介导等温扩增方法

目的:设计一种快速环介导等温扩增(LAMP)检测方法,用于恶性疟原虫的检测。方法:根据恶性疟原虫18S r RNA基因设计一组引物,包括外引物、内引物、环引物及第二对环引物,用于恶性疟原虫的LAMP检测。结果:双环引物LAMP检测法灵敏度可达10拷贝DNA模板/μL,可特异地检测出恶性疟原虫DNA,3次重复试验Ct值的CV小于5%,比普通加环引物LAMP检测法时间缩短10 min左右,提高了反应的检测效率。结论:建立的双环引物LAMP方法是一种高效、快速的检测方法。

快速检测HPV16的环介导等温扩增检测法的建立

目的建立快速检测人乳头瘤病毒16(HPV16)的环介导等温扩增法(LAMP)法。方法针对HPV16 E7区设计LAMP引物,建立LAMP反应体系,对其检测敏感度进行了验证,并与PCR法、LAMP加环引物法、LAMP试剂盒法进行了比较结果利用LAMP方法能成功检测到HPV16病毒E7区的基因,等温条件下反应60 min即可较好完成检测;加入环引物的LAMP法敏感度高于PCR法,与LAMP试剂盒法敏感度一致,为103稀释倍数。结论 LAMP方法具有灵敏度高,操作简便快捷,无需复杂特殊仪器的优点,适用于HPV16病毒的快速检测,具有很好的开发应用前景。

环介导等温扩增技术的引物设计与筛选研究

[目的]研究引物设计与非特异扩增之间的关系.[方法]以单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的特异性基因hlyA与沙门氏菌（Salmonella）的特异基因invA为例设计引物,进行环介导等温扩增.[结果]就环介导等温扩增的任何2条引物而言,如果2条引物3’端的3～4碱基在同一条引物上都有2个互补序列,在常用的LAMP反应体系与反应条件下,必然有非特异性扩增,LAMP引物设计与筛选应避免这种情况出现.[结论]按照该试验的原则设计引物,可降低非特异性扩增.

两种实时定量RT-PCR方法检测miRNAs表达的技术分析

目的比较两种实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测microRNAs(miRNAs)表达含量的技术差异,优化不同实验目的和条件下研究miRNAs表达的技术方法。方法取21d和42d两个时间点的SD大鼠关节软骨组织,采用Trizol法提取总RNA备用。选取rno-miR-15b、rno-miR-16、rno-miR-195、rno-miR-497作为研究对象,分别用茎环引物和试剂公司提供的试剂盒方法反转录总RNA,并应用实时定量PCR方法检测这些miRNAs的表达量。提取人血浆中总RNA,用上述两种RT-qPCR方法实时定量检测has-miR-16的表达量。结果两种方法检测这些miRNAs表达量,在大鼠21d和42d这两个时间点其表达量变化趋势相同,都呈现增高的趋势,这与我们前期Solexa测序结果相同。在血浆中的结果显示,其中茎环引物反转录方法灵敏度相对较高。结论茎环引物法在少量几个重要的miRNAs检测中具有优势,而试剂盒方法适用于大量miRNAs的筛查。

内引物在环媒恒温基因扩增技术中的作用研究

目的研究内引物在环媒恒温基因扩增(LAMP)中的作用,确定利用LAMP的同一套特异性引物区别具有单核苷酸差异的不同株型或同一株型的病原菌基因的可行性。方法采用PCR介导定点突变法对沙门氏菌invA基因定点突变,使其T669→A669、T725→A725,用原LAMP特异性引物扩增含单核苷酸差异序列,观察扩增结果。结果制备的点突变模板C大小与预期值(1 371 bp)一致。LAMP扩增的伤寒沙门氏菌CMCC50098标准株DNA产物的电泳条带呈梯状,而扩增模板C未扩出反应产物。结论LAMP不能利用同一套引物扩增具有单核苷酸差异的不同株型或同一株型的病原菌,即可利用同一套引物区分这些病原菌。

环介导等温扩增方法在生物检测方面的研究进展

综述了环介导等温扩增(LAMP)技术的原理、引物设计、方法创新、应用、技术特点等,并指出了LAMP技术的优点及可能存在的问题。

茎-环RT-PCR法定量miRNA-421的引物设计

本研究旨在通过茎-环RT-PCR法,建立有效定量miRNA-421的PCR方法,探讨该方法在定量检测miRNA方面的应用价值.利用miRBase数据库获得miRNA-421的成熟序列.设计3条miRNA-421特异性反转录引物,Q-PCR上游引物及通用下游引物.通过10倍梯度稀释RNA后特异性反转录,RT-PCR分析不同引物互相配对PCR的扩增曲线及熔融曲线,鉴定出特异性好、扩增效率高的引物.为进一步鉴定引物的有效性,过表达miRNA-421,用鉴定的成熟引物定量扩增.利用茎-环RT-PCR法设计、鉴定出miRNA-421引物:421RT7、F19,且这对引物特异性好、扩增效率高.通过设计引物组合,茎-环RT-PCR法能够很好地用于miRNA定量分析,并具有准确、快速、节约成本的优点.

环介导恒温扩增技术及其在昆虫学领域的应用前景

环介导恒温扩增技术是一种新颖的核酸扩增技术。本文介绍了环介导恒温扩增(LAMP)技术的原理、引物设计、扩增机制、产物检测等方面的内容,归纳了LAMP技术与常规PCR方法的优缺点;并对LAMP技术在病毒、细菌、寄生虫检测中的应用现状进行了阐述,展望了LAMP技术在昆虫检测鉴定领域的应用前景。

柞蚕核型多角体病毒实时荧光LAMP检测方法的初步建立

柞蚕脓病是柞蚕生产上的主要病害之一,病原为柞蚕核型多角体病毒(Ap NPV)。建立快速而准确检测蚕体样品中Ap NPV的技术,将有助于对病害的早期诊断及流行病学调查和实施有效的防控措施。以柞蚕核型多角体病毒ORF142基因为靶基因,设计2组特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,利用实时荧光PCR技术进行检测分析。结果表明,设计与合成的2组引物均能对柞蚕核型多角体病毒基因组扩增出特异性产物,其中引物组2在63℃开始孵育60 min,反应起始扩增时间为12 min,当反应时间达到40 min时,扩增曲线的最大相对荧光强度(RFU)值达6 000,相对于引物组1具有更好的及时性,可缩短一半反应起始时间。初步建立的Ap NPV实时荧光LAMP检测方法相对于传统PCR方法,检测效率提高4倍左右。

常见肉制品动物源性的环介导等温扩增高分辨熔解鉴别检测方法

动物源性成分鉴别在肉制品掺假检测中具有重要意义。为检测肉及其制品中猪、牛、羊3种动物源性成分,该研究建立基于通用引物的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)高分辨熔解曲线(high-resolution melting,HRM)检测方法。该方法对猪、牛、羊DNA的检测灵敏度分别可达0.3 pg/μL、0.03 pg/μL、0.3 pg/μL;通过分析通用引物扩增子的熔解曲线可实现牛肉、羊肉中分别掺入5%和1%猪肉的鉴别,并成功应用于市售样品检测。该方法快速、灵敏、准确度高,可以实现仅用1组LAMP引物区分猪、牛、羊3种动物源性成分,是一种有效的动物源性成分鉴别方法,在肉及肉制品动物源性成分检验的快速检测中具有良好的发展前景。

生殖道病原菌LAMP检测的环引物设计与优化

孕期生殖道病原菌感染是威胁妇女和胎儿健康的常见疾病之一,为改进现有检测方法耗时长的缺陷,对基于环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)的生殖道病原菌快速检测方法进行优化。在Gardnerella vaginalis的LAMP检测体系中,通过对不同环引物组扩增速率(Ct值)进行统计学分析,验证了环引物在LAMP反应中提升扩增速率的能力,同时探究了环引物长度和GC含量对扩增速率的影响,并将其作为环引物筛选参数应用于3种生殖道病原菌(G.vaginalis、Streptococcus agalactiae、Enterococcus faecalis)检测的环引物设计。结果表明,不同GC含量的环引物扩增速率差异不显著,而环引物的长度是影响其扩增效果的关键因素,碱基数较少的环引物有利于提高LAMP反应速率(p<0.05),设计出的引物组GV-1、GBS-132和EF-3可以在105 CFU/mL扩增浓度下在30 min内呈现完整“S”扩增曲线,具有较好的临床病原菌筛查应用潜力。

口蹄疫病毒群特异性RT-LAMP检测技术的建立及试用

为实现对口蹄疫病毒(FMDV)感染的现场快速检测,本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列,截取并比对FMDV高度保守的3D(RNA聚合酶)基因序列,设计17套环介导等温扩增引物,并对反应体系和反应条件进行优化,建立FMDV群特异性RT-LAMP技术。该技术在反应前用石蜡密封PicoGreen染料,实现了免开盖可视化判定检测结果;该技术对PRV、PRRSV、AKAV、BTV-1、BTV-16、EHDV、CHUV等偶蹄动物病毒未见非特异性扩增;最低可检测3.4×10;ng/μL的病毒RNA,灵敏度是RT-qPCR技术的10倍,是一步法RT-PCR的100倍;尝试应用RT-LAMP对94份RNA临床样品进行检测比对,该检测方法与RT-PCR方法和RT-qPCR方法对临床样品检测的符合率均为82.8%。本研究建立的FMDV群特异性RT-LAMP快速核酸检测技术,具有准确性高、快速简便的优点,可用作家畜FMDV早期感染的现场诊断技术。

中成药中沙门氏菌环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用

目的建立以invA特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法选择沙门氏菌的毒力因子invA基因作为检测模板,采用Primer Exploer V5软件设计3组LAMP引物[正向外引物(F3)、反向外引物(B3),正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP),正向环引物(LF)、反向环引物(LB)],以4种沙门氏菌(甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌)和3种非沙门氏菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产志贺氏毒素大肠埃希氏菌)的细菌DNA为模板,进行LAMP快速检测。结果在反应温度为65℃、反应时间为60 min条件下,即可快速检测4个亚种沙门氏菌,其检测灵敏度可达10 cfu/mL,且试验结果易于观察,筛选的引物特异性良好。结论所建立的方法灵敏度高、特异性好、检测快速,可应用于中成药中沙门氏菌的快速检测。

纺织品中铜绿假单胞菌快速检测方法研究

探讨纺织品中铜绿假单胞菌的快速检测方法。将免疫磁珠富集技术和环介导等温扩增技术结合起来,利用免疫磁珠富集技术富集样品中铜绿假单胞菌,富集液提取DNA,进行环介导等温扩增技术特异扩增。以49株铜绿假单胞菌菌株和21株非铜绿假单胞菌菌株测定特异性,以49株铜绿假单胞菌阳性菌液稀释成不同梯度测试灵敏度。结果表明:该方法特异性、灵敏度符合要求,检测限可达4.5CFU/mL,且简化了测试流程,使检测时间显著缩短。认为:所建立的纺织品中铜绿假单胞菌快速检测方法鉴别准确、快速,尤其适用于基层检验、检疫机构。

网状内皮组织增生症病毒改良型LAMP检测方法的建立

根据网状内皮组织增生症病毒的基因,设计一套环介导等温扩增LAMP)引物,在此基础上加入一条加速引物,进行LAMP反应,优化反应条件,进行特异性和敏感性试验,同时与不加入加速引物的体系比较其敏感性。经过反应条件优化,可通过肉眼观察颜色直接判定结果,在1h内完成整个反应,改良型LAMP检测的敏感性最低达到7fg,是普通PCR方法的200倍,对其他常见免疫抑制性病原体的检测结果均为阴性。本试验建立的检测网状内皮组织增生症病毒的改良型LAMP方法,具有良好的特异性和敏感性,可以在短时间内检测网状内皮组织增生症病毒,在基层兽医工作中具有良好的诊断应用价值。

检测肺炎支原体新方法的建立及应用

目的 建立成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas12a技术结合环介导等温扩增(LAMP)单管一步法快速检测肺炎支原体(Mp),并探讨其在临床诊断中的应用价值。方法 设计并优化Mp LAMP引物,根据LMAP产物靶标设计Cas12a CrRNA。分析CRISPER-LAMP单管一步法检测Mp DNA的灵敏度;检测Mp、甲流病毒(FluA)、乙流病毒(FluB)、肺炎克雷伯菌(Kp)和肺炎链球菌(Sp)及50例临床样本,评估CRISPER-LAMP单管一步法的特异性。结果 CRISPER-LAMP单管一步法可在1 h内实现Mp DNA的可视化检测,检出限为10 fg/μL,聚合酶链式反应(PCR)法检出限为100 fg/μL;CRISPER-LAMP单管一步法检测FluA、FluB、Kp和Sp结果均为阴性;50例临床样本检测结果均与临床诊断结果相符,且CRISPER-LAMP与PCR法一致性较好(Kappa=1)。结论 CRISPER-LAMP单管一步法检测Mp简便、快速、灵敏度高,且特异性强,检测不需任何特殊设备,检测过程中无气溶胶污染,其有望成为快速检测Mp的新方法。