神经酰胺对结核杆菌低分子多肽抗原诱导的γδT细胞活化及凋亡作用

目的 :研究神经酰胺对结核杆菌低分子多肽抗原 (Mtb)诱导的γδT细胞活化及凋亡作用。方法 :用结核杆菌低分子多肽抗原刺激正常人PBMC ,并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδT细胞。通过MTT试验观察神经酰胺、鞘磷脂酶以及神经酰胺合成酶抑制剂FumonisinB1对γδT细胞的活化作用 ;FACS检测其对γδT细胞的凋亡作用。结果 :Mtb刺激获得的γδT细胞可达 73 % ,磁珠分选后可高达 98% ;高浓度神经酰胺及鞘磷脂酶能抑制γδT细胞的增殖 ,而出现凋亡 ,FumonisinB1则对γδT细胞的增殖及凋亡无明显影响。结论

广东汉族人群LMP和TAP基因多态性及与变应性鼻炎的相关性

目的对广东地区汉族变应性鼻炎患者作抗原处理相关肽(TAP)和低分子量多肽(LMP)分型,探讨这些基因与广东人群中变应性鼻炎遗传易感性的可能关系。方法采用PCR扩增阻碍突变系统(PCR-ARMS)法和PCR-RFLP法对62名无亲缘关系的变应性鼻炎病人和95名无血缘关系的广东籍健康汉族人作TAP、LMP分型。结果TAPl-333、637位等位基因基因型在广东汉族变应性鼻炎组及正常对照组中均以I和D为主,TAP2-379、565、665等位基因基因型分别为V-A-T。TAP1和TAP2各等位基因基因型频率在变应性鼻炎组和正常人组间差异无显著性(P>0.05)。变应性鼻炎患者LMP7A/A频率占8.70%,低于正常对照组的21.35%,有显著差异(P<0.05),其余各型与正常对照组无明显差异(P>0.05)。变应性鼻炎病人中LMP7等位基因A的频率占36.23%,B的频率占63.77%,与正常对照组的A为47.09%、B为52.91%有显著差异(P<0.05)。结论提示LMP7等位基因A与AR的发病呈负关联,B与AR的发病呈正关联。变应性鼻炎与TAP基因可能无相关性.

磷脂酰肌醇3激酶特异性抑制剂LY294002对结核杆菌低分子多肽抗原激活γδT细胞的影响

目的观察磷脂酰肌醇3激酶（P13K）特异性抑制剂LY294002对CD3单克隆抗体（CD3mAb）活化的T细胞及结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）激活γδT细胞的影响，探讨P13K在CD3mAb活化的T细胞及Mtb-Ag启动的78T细胞TCR途径信号转导中作用。方法分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC），用CD3mAb、佛波醇酯＋离子霉素（PMA＋IM）、Mtb-Ag刺激PBMC，采用流式细胞术检测CD3’T细胞和78T细胞0、6、12、24、48h和72h的CD69分子的表达情况。PBMC经LY294002（0、0．4、2、10~tmol／L）处理后再刺激培养，用EIA试剂盒检测CD3mAb和PMA＋IM刺激组CD3’T细胞白细胞介素（IL）一2的含量；经CD3PE和CD69FITC、v6PE和CD69FITC双染后，检测LY294002对CD3mAb活化T细胞和Mtb．Ag活化的γδT细胞增殖的影响，并计数培养扩增10d的细胞数量。结果用CD3mAb刺激24hCD3’T细胞和γδT细胞CD69的表达均达高峰（均在56％左右），用PMA＋IM刺激6h，均达高峰（均在99％左右），用Mtb-Ag刺激24h，亦均达高峰，但CD3^＋T细胞和γδT细胞CD69的表达分别为（16．0±0．0）％和（75．2±0．7）％，3组同时间点CD3^＋T细胞CD69的表达之间差异均有统计学意义（均P〈0．05），而78T细胞CD69的表达在PMA＋IM刺激组高于CD3mAb刺激组和Mtb-Ag刺激组（均P〈0．05），后两组差异则没有统计学意义（均P〉0．05）。用LY294002终浓度分别为0、0．4、2、10μmol／L处理的样本，CD3mAb刺激组CD3^＋T细胞CD69的表达分别为（52．0±0．5）％、（46．3±0．4）％、（33．2±0．4）％和（19．1±0．0）％；Mtb-Ag刺激组78T细胞CD69的表达分别为（66．2±0．6）％、（58．4＋0．5）％、（38．1±0．3）％和（19．3±0．1）％。0、0．4、2、10μmol／LLY294002处理CD3＋T细胞后，CD3mAb刺激组IL-2的含量分别为（561．1±86．2）、（477．0±75.5）、（280．3±53．9）、（36．0±8．7）ng／L，PMA＋IM刺激组为（1922．2±371．3）、（1928．3±381．7）、（1938．1±262．1）、（1915．4±201．6）ng／L。CD3^＋T细胞的总数由培养前的1．5×10^6分别增殖到（35．6±8．4）×10^6、（31．1±7．3）×10^6、（18．7＋5．0）×10^6和（7．0±2．0）×10^6；γδT细胞的总数由培养前的1．5×10^6分别增殖到（7．0±1．1）×10^6、（4．7＋1．0）×10^6、（1．3＋0．8）×10^6和（0.2±0．1）×10^6。结论Mtb-Ag可特异性的激活78T细胞，其活化信号转导需通过TCR通路，LY294002对CD3mAb活化的T细胞及Mtb-Ag启动的γδT细胞具有明显的抑制作用。

γδT细胞的扩增及其信号转导分子ζ链相关蛋白-70的免疫印迹检测

目的 检测人外周血γδT细胞的信号转导分子ζ链相关蛋白-70 （ZAP-70）的表达.方法 应用淋巴细胞分离液常规分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC）,用结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）刺激PBMC增殖培养,10d后收集细胞,用免疫磁珠阳性分选法分离获取高纯度的γδT细胞；采用免疫印迹方法检测γδT细胞内的ZAP-70分子.结果 新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为4.9％,Mtb-Ag刺激培养10d后升为69.2％,免疫磁珠阳性分选后达99.3％.免疫印迹显示检测到γδT细胞内相对分子质量为70 000的ZAP-70分子的表达.结论 ZAP-70分子在活化增殖的人外周血γδT细胞内高表达.

海南黎族人群LMP/TAP基因单倍体型与结核病的相关性

目的探讨中国海南黎族人群低分子量蛋白酶体、抗原处理相关转运体基因单倍体型与肺结核病(TB)感染的易感性关联。方法应用PCR-RFLP技术对205例海南黎族肺结核患者及217例海南黎族健康人群LMP基因(即LMP2 Codon60/LMP7 Codon145这两个多态位点)和TAP基因(/即TAP1-1 Codon333/TAP1-2 Codon 637这两个多态位点)共四个多态性位点进行检测,采用PHASE1.0软件构建这四个多态性位点的个体单倍体型,并对其易感性进行分析。结果对所有的研究对象进行PCR-RFLP检测结果显示:LMP基因和TAP基因在两组人群中具有多态性;在这四个位点所构建的单倍体型中,我们的研究发现含有--B/+B/B、--/H+H/H单倍体型的个体在两组人群中差异有显著性,分别为OR=3.674,P<0.0001,95%CI[2.254-5.9888]和OR=3.573,P=0.009,95%CI[1.379-9.263];--/G+G/G、--/I+I/I单倍体型高于对照组,有统计学意义(P<0.05),分别为OR=0.33,P=0.043,95%CI[0.115-0.968]和P=0.034,OR=2.91,95%CI[1.084-7.807]。结论在这两个基因四个位点所构建的单倍体型中具有--B/+B/B、--/H+H/H单倍体的个体对于海南黎族结核的发生具有更强的易感关联,其增加结核患病风险约为3.674倍和3.573倍;而--G/+G/G、单倍体型和--/I+I/I单倍体型在病例组和结核组比较,均有统计学意义,(P<0.05),显示弱相关性;对于结核的发生也有着弱的易患关联,其增加结核患病风险约为0.33倍和2.91倍。

Mtb-Ag活化γδT细胞的扩增及对γδT细胞CD69分子表达的影响

目的 用结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）激活和扩增γδT细胞,观察γδT细胞表面CD69分子表达的情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC）,用Mtb-Ag刺激PBMC,所得细胞用磁珠阳性分选,通过荧光单抗TCR γδPE染色及流式细胞仪检测γδT细胞所占比例.用γδPE/CD69FITC细胞双染检测初次刺激和再次刺激γδT细胞CD69分子的表达情况.结果 新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为（4.9±1.85）％,Mtb-Ag刺激培养10d后升为（69.2±6.57）％,免疫磁珠阳性分选后达（99.3±8.92）％.Mtb-Ag初次刺激γδT细胞,CD69分子的表达24 h达高峰,为75.2％;Mtb-Ag再次刺激γδT细胞,CD69分子的表达6h达高峰,为72％.结论 Mtb-Ag能特异地刺激PBMC中的γδT细胞增殖,Mtb-Ag初次和再次刺激均可特异性活化γδT细胞.