鲜食糯玉米己醛和己醇的生成与LOX活性及其基因表达的相关性

为探讨生鲜糯玉米汁主要挥发性成分己醛与己醇的生成与脂氧合酶(LOX)的关系,对4个籽粒发育期的鲜食糯玉米京甜紫花糯2号和苏玉糯11号生鲜玉米汁中己醛与己醇含量、脂氧合酶活性以及Zm LOX1、ZmLOX2、Zm LOX3、Zm LOX10基因的相对表达量进行了测定和比较。结果显示己醛与己醇含量显著正相关(P<0. 05),4种LOX基因的表达量之间显著正相关(P<0. 05),但LOX活性与其他指标之间未表现出显著的相关关系。主成分分析(PCA)结果显示所有指标聚为3类:4种LOX基因表达量、己醛与己醇含量、LOX活性,三者之间未表现出显著的相关性关系。

猕猴桃6个LOX基因家族成员实时定量PCR引物特异性的检测与应用

从基因家族成员的视角开展基因表达研究是阐明基因功能的重要组成内容,实时定量PCR(QPCR)技术是分析基因表达的有效手段.以猕猴桃脂氧合酶(LOX)基因家族6个成员为对象,分析了引物特异性的检测方法.该方法整合了熔点曲线分析、琼脂糖电泳、交叉PCR扩增和PCR产物测序等分析手段,有效消除其它成员的交叉扩增干扰,为利用QPCR检测基因家族成员表达提供了特异、准确与可行的途径.

Cre/lox位点特异性重组系统在高等真核生物中的研究进展

来自于P1噬菌体的Cre/lox系统通过位点特异性重组可以迅速而有效地实现各种生理环境下的基因定点插入、删除、替换和倒位等操作。Cre/lox系统作为目前基因打靶技术的核心工具,已被广泛应用于拟南芥、水稻、小鼠、果蝇、斑马鱼等高等真核模式生物。文章较为全面地介绍了Cre/lox系统的基本概况及其在高等真核生物中的应用,讨论了Cre/lox系统在研究中存在的主要问题和今后的发展方向,为利用该系统在不同高等生物中进行基因操作提供有用的参考。

野生花生全基因组抗病相关LOX基因的生物信息学分析

脂肪氧合酶（lipoxygenases，LOX）是生物体内一种重要的双加氧酶，其在植物发育以及响应生物和非生物胁迫时发挥重要作用。本研究从 Arachis duranensis 和 Arachis ipaёnsis 两个野生花生基因组中各鉴定出18个 LOX 基因，分别命名为 AdLOX1～18和 AiLOX1～18。在 AdLOX5、AdLOX7、AiLOX8和 AiLOX18基因的CDS 序列中发现提前终止翻译的终止密码子，而 AiLOX9基因的 CDS 序列过短，推测这些基因可能是假基因。染色体定位结果显示，AdLOX 和 AiLOX 基因主要分布在2、3、6、8、9和10号染色体上，且其直系同源基因分布在两套染色体相同或相近的位置。通过分析 AdLOX 和 AiLOX 基因与已知功能 LOX 基因的亲缘关系发现，Ad-LOX6、AdLOX9、AdLOX11、AdLOX12、AdLOX17、AiLOX1、AiLOX4、AiLOX6、AiLOX16和 AiLOX17基因可能参与花生的抗病过程，启动子分析结果也支持这一结论。基因选择压力研究表明，AdLOX 和 AiLOX 基因在进化历程中受到纯化选择。

中国荷斯坦奶牛LOX-1基因3′UTR的PCR-SSCP分析

为了寻找影响奶牛产奶性状的候选基因,采用PCR-SSCP分子标记方法,对中国荷斯坦奶牛LOX-1基因3′非编码区进行了多态性分析。结果表明,在中国荷斯坦奶牛中检测的LOX-1基因3′UTR有AA型、BB型和AB型3种基因型,其频率分别为0.1374,0.3130和0.5496;不同基因型与中国荷斯坦奶牛的乳脂率之间有显著的相关性(P<0.05),但对乳蛋白率、产奶量和体细胞评分(SCS)影响不大,未达到显著水平。初步认为LOX-1基因可能是控制中国荷斯坦奶牛产奶性能的一个候选基因,或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。

cre/lox P系统介导的基因重组研究进展

由于具有时间、组织和位点特异性 ,cre重组酶介导的DNA重组已成为基因靶位操作的一个重要工具。概述了cre/loxP系统的作用特点 ,cre重组酶的结构和重组机制 ,表达载体构建及重组个体检测等方面的问题 ,重点介绍了cre/loxP系统在基因重组研究中的应用及近来的发展与成就。

Cre/lox系统介导的位点特异性重组技术及其应用

Ｃｒｅ／ｌｏｘ系统是源于Ｐ１噬菌体的一个ＤＮＡ重组体系，它能导致在特定的ＤＮＡ序列（ｌｏｘＰ位点）处发生定点重组。该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定ＤＮＡ片段删除；这种定位重组系统在遗传操作中发挥了重要的作用。

血脉脂康胶囊对高血脂症兔OX-LDL水平及LOX-1表达的影响

目的探讨血脉脂康胶囊对高血脂症兔氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)水平及植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-(LOX-1)表达的影响。方法:应用胆固醇、高脂灌胃法制作兔高血脂症模型,实验设正常组、模型组、对照组(辛伐他汀)和中药组(血脉脂康胶囊)。在实验的0周、5周和10周(实验结束)时分别检测各组动物的OX-LDL水平,并在实验结束时应用RT-PCR法检测LOX-1 mRNA的表达。结果实验第5、10周时中药组OX-LDL水平明显低于模型组;实验结束时中药组LOX-1基因表达亦明显低于模型组。结论血脉脂康胶囊可降低高血脂症动物的OX-LDL水平和LOX-1的表达,从而达到治疗AS的目的。

利用Cre/lox重组系统获得无选择标记的SKTI抗虫转基因烟草

将置于两个同向lox位点之间的Bar基因表达盒与大豆胰蛋白酶抑制剂SKTI基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草Wisconsin 38后获得对棉铃虫具有明显抗性的SKTI转基因植株。SKTI转基因植株通过叶盘二次转化法导入Cre基因,对再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,检测Bar基因的删除情况。结果表明：绝大多数再生植株对应叶盘在含8 mg/L PPT的筛选培养基上无法再生,Bar基因被删除的效率在38%-100%之间。对Bar基因删除区域进行PCR及克隆测序后发现Bar基因表达盒被精确删除。对Bar基因删除植株开花自交获得的分离后代进行NPTⅡ抗性检测,5株NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有SKTI基因而无Cre基因存在,为无选择标记基因的SKTI转基因植株。

胡麻脂氧合酶基因LuLOX1的克隆与表达分析

胡麻的籽粒富含多不饱和脂肪酸-亚麻酸,易被脂氧合酶(LOX)氧化,导致油脂的酸败。因此,油脂的稳定性和风味是影响胡麻油质量的重要因素。脂氧合酶是一类非血红素双加氧酶,其催化不饱和脂肪酸如亚油酸和亚麻酸的氢过氧化反应。本研究旨在阐明在胡麻种子发育时期脂氧合酶基因(LuLOX1)的表达、酶活性与品质的关系。本试验利用基于亚麻全基因组DNA测序数据,对LuLOX1基因进行克隆,利用RT-PCR方法进行LuLOX1基因表达分析,采用分光光度计法进行LOX酶活性测定。结果显示,LuLOX1基因的cDNA全长为2 607 bp,编码868个氨基酸,LuLOX1蛋白分子质量和等电点分别为98.87 kD、6.36。LuLOX1在种子发育早期高表达,之后呈下降的趋势,成熟期几乎检测不到该基因的表达。LuLOX1的酶活性变化与LuLOX1基因表达模式一致。该研究结果表明,LuLOX1可能参与了种子发育过程中脂肪酸氧化的调控。本研究为进一步研究其功能,通过脂氧合酶调控改进胡麻油脂品质奠定了基础。

LOX基因G473A多态性研究在结直肠癌患者肿瘤风险评估中的应用

目的研究赖氨酰氧化酶(LOX)基因G473A多态性与结直肠癌易感性的关系,为结直肠癌肿瘤的风险评估提供依据。方法随机选择2010年5月~2014年8月我院收治的200例结直肠癌患者作为研究对象,并随机选择同期200例体检健康者作为对照组,分别抽取所有研究对象的肘静脉血5 mL和抽取基因组后对LOX基因G473A位点测序,检测各个体LOX基因G473A的基因型。然后采用Logistic回归分析不同LOX基因G473A基因型与结直肠癌患病风险之间的相关性。结果 (1)结肠癌组GG、GA、AA基因型患者分别占47.37%(45/95)、41.05%(39/95)、11.58%(11/95)。携带GG基因型个体患结肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体(OR=1.71,95%CI=1.01~2.65,P=0.03;OR=3.94,95%CI=1.43~8.96,P=0.00)。(2)直肠癌组GG、GA、AA基因型患者分别占51.43%(54/105)、37.4%(39/105)、11.43%(12/105)。携带GG基因型个体患直肠癌的风险明显低于AA基因突变型个体(OR=3.45,95%CI=1.61~8.03,P=0.00)。(3)结直肠癌组GG、GA、AA基因型患者分别占49.50%(99/200)、39.00%(78/200)、11.50%(23/200)。携带GG基因型个体患结直肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体(OR=1.67,95%CI=1.01~2.18,P=0.03;OR=3.68,95%CI=1.81~7.65,P=0.00)。结论 LOX基因G473A多态性与结直肠癌的发病风险有一定关系,行LOX基因G473A多态性检测在结直肠癌风险评估中具有一定的应用价值。

LOX-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建LOX-shRNA的慢病毒表达载体及其病毒包装鉴定。方法利用Oligo Designer 3.0,根据人LOX基因序列设计shRNA,并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入LOX表达载体中,构建shRNA表达质粒,并转化至E.coli TOP10感受态细胞,抽提质粒后进行测序。将重组质粒转染HEK-293T细胞,应用RT-PCR检测各组LOX基因mRNA的表达水平,筛选出最有效的LOX-shRNA后,通过Lipofect AM INE^(TM)2000介导转染293T细胞,对慢病毒进行包装并测定慢病毒滴度。结果利用慢病毒介导将重组质粒LOX-shRNA-3024高效转导入HEK-293T细胞并稳定表达。荧光显微镜显示,转染24 h后,HEK-293T细胞即开始发出绿色荧光;72 h后,有大量荧光表达,而对照组未转染质粒的HEK-293T细胞不表达,可见慢病毒载体被成功转染。LOX-3024重组慢病毒的滴度为2×10^(10)TU/ml。结论成功构建LOX-shRNA慢病毒表达载体,并稳定转染HEK-293T细胞,为研究LOX对人阴道壁成纤维细胞生物学行为的影响提供了实验基础。

利用Cre/lox定位重组系统获得无选择标记GFP转基因烟草

【目的】利用Cre/lox系统具有的特异重组特性,以绿色荧光蛋白GFP为目的基因,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【方法】将Bar基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与GFP基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草后获得抗除草剂Basta的GFP转基因植株。GFP转基因植株叶盘二次转化导入重组酶Cre基因后,实现与GFP基因连锁的Bar基因表达盒剔除,剔除Bar基因的植株开花后自交使重组酶Cre基因分离,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【结果】将含Bar基因表达盒以及GFP基因表达盒的植物表达载体转化烟草Wisconsin38后获得了抗除草剂Basta以及GFP荧光表达的转基因植株。随机抽取5株转基因植株二次转化导入Cre基因,所获得的再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,绝大多数单株对应叶盘在含8mg·L-1PPT(phosphinothricin)的筛选培养基上无法再生死亡,删除效率在76%～100%。对Bar基因删除后区域片段进行克隆测序分析显示,Bar基因表达盒已经被精确删除。Bar基因删除植株开花后自交,获得的自交后代进行NPTⅡ抗性检测,NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有GFP基因。【结论】利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的,可广泛应用于其它无选择标记转基因植物的培育。

利用Cre/lox重组系统建立反义基因工程雄性不育恢复系

利用Cre/lox重组系统中的Cre重组酶能特异性识别并介导两个同向lox位点之间DNA序列发生重组删除的特点,将TA29驱动下的反义豌豆卷须肌动蛋白基因置于两个同向lox位点之间并与Bar基因连锁,转化烟草Wisconsin 38后获得抗除草剂Basta的转基因植株。将Cre基因导入烟草Wisconsin 38建立雄性不育工程恢复系。反义Actin转基因植株与Cre转基因植株杂交获得F1,通过Cre重组酶将F1中的反义肌动蛋白基因表达盒删除实现育性的恢复。结果显示:来自豌豆卷须的肌动蛋白基因在Wisconsin 38烟草绒毡层中反义表达但未能导致明显的雄性不育,转基因植株在花器官形态、花粉形状、活力、结实、结籽等方面与野生型植株间无明显的差异。而获得的烟草Cre转基因工程恢复系除少量植株出现叶片褪绿、结果少等异常外,绝大多数植株形态结构及开花结果习性与野生型一致;其中3个Cre转基因工程恢复系与Actin反义肌动蛋白转基因植株TAA-3杂交后,杂交后代中的绝大多数反义肌动蛋白基因表达盒均被精确删除,表明将Cre/lox重组系统用于建立基于反义基因工程雄性不育的恢复系是可行的。

星星草脂氧合酶基因家族鉴定及生物信息学分析

星星草具有较强的耐盐碱特性,是改良土壤盐碱化的优良牧草。脂氧合酶(lipoxygenase,LOXs)广泛存在于动植物中,催化多不饱和脂肪酸的双加氧反应,最终生成各种氧脂素,从而在植物生长发育、响应逆境胁迫中发挥重要的生物学功能。目前,星星草中的LOXs家族基因仍未见报道。本研究利用生物信息学方法对PutLOXs基因家族成员进行鉴定,并对其理化性质、亚细胞定位和系统进化进行了分析。结果表明,星星草基因组中共有8个LOX基因,它们均具有lipoxygenase homology 2(简称LH2)和lipoxygenase结构域,均不包含跨膜结构域,预测定位于细胞质或叶绿体。系统发生分析表明PutLOXs蛋白分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,并且与水稻和玉米这类单子叶植物的LOXs蛋白系统发生关系更近。本研究将为后期深入分析星星草耐盐碱分子机制提供理论依据。

siRNA抑制LOX基因对鼻咽癌细胞增殖能力的影响

目的探讨si RNA扰赖氨酰氧化酶基因(LOX)后对鼻咽癌细胞5-8F的体外增殖的影响。方法设计并构建针对LOX基因的si RNA段,脂质体介导Si RNA-LOX-01(Si RNA-LOX-01组)和Si RNA-LOX-02(Si RNALOX-02组)转染5-8F细胞,同时设非特异性干扰片段为对照组。应用实时荧光定量PCR、免疫印迹试验检测转染后各组LOX m RNA和蛋白表达及Ki-67、PCNA、CDK4、P21、CCND1表达变化;MTT实验、平板克隆形成实验及流式细胞周期实验分别研究LOX基因沉默后对5-8F细胞增殖能力的影响。结果与对照组比较,Si RNA-LOX-01组和Si RNA-LOX-02组LOX表达在m RNA及蛋白水平上均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,si RNA-LOX细胞的增殖速度变慢,单克隆形成数量减少,细胞周期中G0/G1期细胞的比例显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);与对照组相比,Si RNA-LOX-01组和Si RNA-LOX-02组细胞中抗原Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、细胞周期蛋白D1(CCND1)的表达均降低,P21表达量升高,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论干扰LOX能明显抑制鼻咽癌细胞的增殖能力,其作用机制可能与Ki-67、PCNA、CDK4及CCND1蛋白表达下调,P21蛋白表达上调有关,LOX有望成为治疗鼻咽癌的有效靶点。

茶树LOX基因家族的鉴定及其在白茶萎凋过程的表达分析

脂肪族类化合物是植物芳香物质的重要组成部分,对白茶香气的形成具有重要作用。利用生物信息学方法,在染色体级别的茶树基因组数据库中,对LOX基因家族进行鉴定,从中获得12个茶树LOX基因家族成员,命名为CsLOX1~CsLOX12。12个茶树LOX基因序列,主要定位于细胞质或叶绿体中,其编码蛋白具有相同的特征结构域及保守基序。系统进化树分析表明LOX基因家族分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,CsLOX2、CsLOX3、CsLOX4、CsLOX7为9-LOX亚型,其余为13-LOX亚型;基因结构分析表明CsLOX1含有8个外显子,其余均含有9个外显子;不同组织转录组数据分析结果表明,该家族在茶树嫩叶、成熟叶部位高表达;上游启动子区域分析发现大量与植物生长发育、光响应、激素及胁迫响应密切相关的顺式作用元件。荧光定量PCR检测发现,CsLOX基因家族在干旱、低温及茉莉酸甲酯处理下均有不同程度的表达,在白茶不同萎凋时间处理下,CsLOX1、CsLOX3、CsLOX5、CsLOX7、CsLOX8、CsLOX9、CsLOX11和CsLOX12的表达量被诱导上调,4 h时表达量最高(最高上调27倍)。结果表明,CsLOX基因家族成员参与白茶加工萎凋过程脂肪族香气形成的调控,为探明白茶加工过程香气形成的分子机制奠定基础。

髓系特异性Spi1基因敲除小鼠的构建和基因鉴定

目的构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法根据CRISPR/Cas9技术原理和Cre/LoxP系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2两侧各放置同向Loxp元件;将Cas9蛋白、sgRNA和Donor载体混合显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宫中,19~20 d后获得F0代。将阳性F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到稳定的F1代Spi1^(flox/+)小鼠。F1代Spi1^(flox/+)小鼠雌雄自交得到Spi1^(flox/flox)小鼠。Spi1^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠交配得到Spi1^(flox/+)/Lyz2-Cre^(+)小鼠,再将其与Spi1^(flox/flox)交配,得到的Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(+)小鼠为髓系特异性Spi1基因敲除(KO)小鼠;Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(-)小鼠作为野生型(WT)小鼠。提取WT和KO小鼠DNA,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型;Western blot检测WT和KO小鼠免疫细胞中脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1/富含嘌呤盒1(PU.1)表达。结果PCR鉴定结果显示,采用flox引物鉴定时仅扩增出220 bp条带的小鼠,即基因型为Spi1^(flox/flox)纯合子,采用Lyz2-Cre引物鉴定时扩增出700 bp的小鼠,基因型为Lyz2-Cre^(+);Western blot结果显示,与WT组比较,KO组小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(PM)中的PU.1不表达(P<0.01);T细胞中KO小鼠PU.1表达水平与WT小鼠差异无统计学意义;PCR和Western blot结果均表明髓系特异性Spi1 KO小鼠构建成功。结论成功构建和鉴定髓系特异性Spi1 KO小鼠,为进一步揭示PU.1在免疫调节中的潜在机制研究提供动物模型基础。

高粱LOX基因家族全基因组鉴定及表达模式分析

利用生物信息学技术鉴定高粱脂氧合酶(LOX)家族基因,并对其进化关系、基因结构、保守基序、不同组织及低温胁迫下的表达模式等进行分析,以此为高粱LOX基因的功能研究奠定基础。结果表明,共鉴定出11条高粱LOX家族基因,根据其染色体位置命名为SbLOX1—SbLOX11,该家族基因可分为2个亚族(9-LOX、13-LOX)且同一亚族基因结构基本相似。表达分析发现,不同基因家族成员在不同组织部位的表达模式各不相同,SbLOX10和SbLOX9基因在各个组织部位中表达量均较低,SbLOX2—SbLOX5、SbLOX8在各个组织部位中表达量均较高。对低温(4℃)处理下高粱LOX基因转录组数据进行分析发现,耐冷型高粱9-LOX亚族中的SbLOX1、SbLOX3、SbLOX5和13-LOX亚族中的SbLOX4、SbLOX9在大多时间点均呈上调表达,且在冷敏感材料中表达量也较高,推测LOX基因在低温胁迫响应中具有重要作用。

娟珊牛LOX-1基因多态性与产奶量的关联分析

为了研究娟珊牛LOX-1基因的多态性与产奶量的相关性,试验采用PCR产物直接测序的方法,分析娟珊牛LOX-1基因内含子4和3'非编码区的多态性,统计不同基因型娟姗牛305 d的平均产奶量,然后分析娟姗牛LOX-1不同基因型与产奶量的关联性。结果表明:在娟珊牛LOX-1基因内含子4检测到2个SNPs,均有3种基因型,分别为CC、CT、TT和AA、AG、GG,但不同基因型个体间的305 d平均产奶量差异不显著(P>0.05);在3'UTR区检测到1个SNP,有CC和AC 2种基因型,其中CC型为优势基因型,其频率为0.909 1,且其个体的305 d平均产奶量高于AC型(P>0.05)。基因型组合效应分析发现CTAGCC为优势组合基因型,但不同的组合基因型间305 d平均产奶量差异不显著(P>0.05)。