从伪狂犬病病毒中删除Cre/LoxP介导的报告基因

根据pEGFP-C1序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出两端各含一个同向LoxP位点的GFP表达盒,克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-G-LoxP。通过经典同源重组方法,得到表达GFP的TK基因缺失伪狂犬病毒重组毒株S03109。该重组病毒在转染了pOG231(表达Cre重组酶)的293T细胞上连续传代,筛选得到重组病毒株S0419。荧光显微镜观察、Western blot及PCR检测结果表明,S03109感染细胞后持续表达GFP,而S0419不表达GFP。PCR证实S0419为含单个LoxP位点的TK基因缺失病毒,并且在细胞培养上遗传稳定,测序结果(GenBank登录号AY822465)表明,在Cre重组酶的作用下,两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去。对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)及免疫保护实验结果表明,S03109和S0419对BALB/c小鼠的LD50值均大于3×105PFU,免疫BALB/c小鼠,攻毒后平均存活率分别为67.5%与70%。以上结果表明,利用Cre/LoxP位点特异性重组系统,成功去除了插入重组伪狂犬病病毒基因组中的GFP报告基因。

Cre/loxP位点特异性重组系统在植物中应用的研究进展

Cre/loxP位点特异性重组系统自发现以来,在植物基因重组领域得到了广泛应用,已成为提高转基因植物安全性的有效方法。本文介绍了该系统的基本概况及其在转基因植物表达载体构建方面的应用,尤其是在基因删除、定点整合、多基因表达以及杂种优势利用等方面的应用做了重点阐述。

Cre/LoxP系统联合SV40 LTag诱导可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系的建立

目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法。方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体(SSR69)转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞;用表达Cre重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,筛选获得回复后成纤维细胞。对原代、永生化及回复后成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态;采用细胞生长曲线法测定细胞增殖能力。免疫荧光染色检测Vimentin在原代及永生化成纤维细胞中的表达情况,平板克隆实验评价回复后成纤维细胞的致瘤性。结果提取了大鼠皮肤成纤维细胞,并筛选出表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞,二者形态无明显差异,均贴壁生长,呈长梭形或多角形,但永生化成纤维细胞体外增殖能力明显高于原代成纤维细胞(P<0.05),在体外培养传代>25代。细胞免疫荧光提示两种细胞均在细胞质内表达Vimentin。回复后成纤维细胞不表达SV40 LTag,其体外增殖能力与原代细胞无明显差异(P>0.05),无致瘤性。结论应用Cre/LoxP系统联合SV40 LTag可以建立可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系。

Cre/loxP介导的伤寒杆菌染色体上插入基因的切除

来源于P1噬菌体的位点专一性重组系统loxP/Cre,已成为一种新的DNA操作的有用工具 ,在体内外都获得了成功的应用 .为了将四环素诱导表达系统引入减毒伤寒杆菌CVD90 8株中 ,tetR loxP neo串联基因已通过同源重组被定位插入在CVD90 8株的△aroC位点中 .构建一Cre酶表达受启动子PLtetO 1控制的自杀质粒 pJG9/Cre ,以切除CVD90 8株△aroC中同向loxP序列之间的neo基因 .质粒pJG9/Cre电转化入菌中 ,加入去水四环素诱导Cre酶表达 ,通过重组切除neo基因 ,再通过自杀质粒上SacB基因的启动 ,使质粒清除出菌细胞 .抗生素鉴定和PCR扩增都证明 ,CVD90

一个含LoxP-FRT重组酶位点及易于操作的植物表达双元载体pYBA100

在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的植物遗传转化中,常常需要用到植物表达双元载体。为便于基因工程操作并能在获得转基因植物后方便将标记基因删除,我们构建了植物表达双元载体pYBA100,以满足用于生产安全转基因植物的需要。本研究通过融合PCR方法,尽可能去除所有非必需的序列,将pYBA载体最小化。pYBA载体在大肠杆菌中为多拷贝,骨架为3.69kb。我们构建的含NptⅡ植物筛选标记基因的载体pYBA100仅为5.37kb,多克隆位点为22个,方便基因工程操作。载体pYBA100的T-DNA植物筛选基因表达框两侧预留有LoxP-FRT融合位点,方便在获得转基因植物后通过Cre或FLP重组酶将植物筛选标记基因删除。pYBA100载体能于大肠杆菌和农杆菌中自我复制,并成功转化了拟南芥,符合农杆菌介导的植物转基因要求。离体删除实验结果证明,载体pYBA100能经Cre重组酶删除植物标记基因表达框。

利用Cre-loxP自动去除禽痘病毒重组体的报告基因

在含痘病毒早晚期启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒侧翼各引入1个loxP序列。以禽痘病毒282E4株作为候选载体,通过同源重组将其插入到病毒基因组的FPV030区域,获得了表达GFP的重组禽痘病毒。然后在Cre酶介导下,利用loxP位点特异性重组剪除了重组病毒基因组中的GFP报告基因。结果表明,以GFP作为筛选标记使重组病毒的构建更为简便,同时利用Cre-loxP系统可以轻松地去除报告基因。这种技术有利于其它抗原性基因重组禽痘病毒的构建。

含有融合标记基因和LoxP/FRT位点的植物表达载体构建及应用

本研究利用化学合成法合成了包含pCAMBIA0390左右边界T-DNA和LoxP/FRT(LF)位点的DNA片段Ⅰ,利用SacⅡ和SphⅠ酶切位点,去除了pCAMBIA0390左右边界T-DNA和多克隆位点之间的序列,然后连接DNA片段Ⅰ和载体片段,构建了植物表达载体pGM323-LF-enTP。随后,再合成含有适合在单子叶植物中表达的由玉米Ubi-1启动子驱动的融合标记基因(Bar::gus)和水稻actin-1启动子驱动的Bt抗虫蛋白基因(Cry1Ab)表达元件的DNA片段Ⅳ,在pGM323-LF-enTP的基础上,利用SalⅠ和PstⅠ位点构建了同时含有LF位点、Bar::gus以及Cry1Ab基因表达元件的表达载体pGM626-LF-ABt。利用含有pGM626-LF-ABt的农杆菌遗传转化烟草和玉米,以草丁膦作为抗性筛选剂,非转化细胞得到了有效抑制,快速获得了转基因植株,利用GUS组织化学检测和RT-PCR分析了转基因植株中标记基因的表达,结果表明pGM626-LF-ABt可以用于农杆菌介导的单、双子叶植物遗传转化。本研究为培育安全抗虫转基因植物奠定了基础。

Cre/loxP位点特异性重组系统及其在口腔医学领域中的应用

Cre/loxP位点特异性重组系统由Cre重组酶和loxP位点组成。Cre重组酶可识别loxP位点并催化2个loxP位点之间的DNA进行精确的位点特异性重组。该系统作用方式简单、重组效率高,可定时、定位地对基因进行修饰,已成为一种定向改变生物活体遗传信息的重要的试验工具。本文主要就Cre/loxP系统的结构、重组机制、特点及其在口腔医学领域中的应用作一综述。

Cre/LoxP系统介导的位点特异性重组技术

Cre/LoxP系统是一种对转入基因进行定点操作的基因重组系统,在遗传操作中具有重要作用。该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片断删除。

Cre／loxp位点特异性重组系统在转基因植物中的应用

位点特异性重组系统能够在植物遗传转化中更准确、可靠的操纵外源DNA的引入或删除,已成为植物遗传操作中的重要工具。本文简要介绍目前应用最为广泛的Cre/loxp位点特异性重组系统的重组机制,并着重阐述Cre/loxp系统在删除转基因植物中标记基因及定点整合等方面的应用。

基于Cre/Loxp系统Tyro3、Axl受体酪氨酸激酶转基因小鼠的建立

目的采用大肠杆菌β-半乳糖酶基因LacZ作为报告基因,建立Tyro3、Axl受体酪氨酸激酶含有loxp位点的转基因小鼠。与不同组织特异性Cre小鼠杂交,获得时空性表达Tyro3、Axl的转基因小鼠,为研究其在各个组织中的功能奠定基础。方法构建含有loxp位点的Tyro3、Axl受体酪氨酸激酶质粒,测序正确后,通过显微注射法将插入CAG启动子下游的Geo-STOP-msAxl及Geo-STOP-msTyro3基因的转基因载体注射入BDF1供体鼠受精卵,移植受精卵至ICR受体鼠,待产仔后,通过双引物PCR鉴定F0以及Fn代小鼠的基因型,RT-PCR,X-gal染色观察小鼠组织中LacZ基因,运用WB(Western Blot)检测转基因小鼠和野生型小鼠体内目的蛋白表达的差异。结果获得了含有目的基因的转基因阳性小鼠;通过RT-PCR对阳性小鼠证明LacZ基因的存在;对存在LacZ基因的小鼠进行X-gal染色,在Geo-STOP-msTyro3的脑、睾丸、胸腺中观察到蓝色沉淀,在Geo-STOP-msAxl的脑、心、肾中观察到蓝色沉淀,间接说明目的基因能表达的组织和器官;对双阳性的Geo-STOP-msTyro3、Geo-STOP-msAxl转基因小鼠和野生型小鼠,WB检验证实Tyro3、Axl基因的表达没有差异,说明在加入stop序列之后,Tyro3基因确实存在,而且表达受到抑制。结论成功建立Geo-STOP-msAxl及Geo-STOP-msTyro3酪氨酸受体转基因小鼠。

Cre-loxp系统的构建及在牙釉质发育中的应用

Cre-loxp系统是近年来广泛应用在各领域的重组酶系统。该系统由组织特异性重组酶cre和loxp位点组成。可以通过对特定的DNA序列进行准确的切割及连接,达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的。牙釉质的发育离不开各种转录因子的作用,利用该系统对各转录因子的缺失或突变的研究,探讨特定时间、特定部位目的基因的异常改变对牙釉质发育的影响。

Cre重组酶结构与功能的研究进展

Cre loxP定位重组系统来源于噬菌体P1 ,由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下 ,设定的DNA片段可以被切除 ,可以发生倒位 ,亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单 ,Cre loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用 ,在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构。

人工雄性不育基因及恢复基因表达载体的构建

结合Cre/loxp定位重组系统和杂种一代的育种特点,构建了雄性不育基因表达载体pCABARTABn和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre。将位于质粒pTTABn中的雄性不育基因表达盒(含TA29启动子、barnase基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp2个同向lox位点之间,再将上述表达盒连同lox位点切下插入pCAMBar,获得以除草剂Basta为筛选剂的雄性不育基因表达载体pCABARTABn。PCR方法从溶原菌BM25.8基因组DNA扩增出Cre基因,克隆测序验证无误后插入PBI525CaMV35S-35S双启动子和Nos终止子之间,再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点,得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre。

表达GFP基因的马立克氏病病毒(MDV)转移载体的构建及初步应用

利用Primerprimer5.0软件设计两条引物,将loxP位点分别引入正、反向引物,以质粒载体pIRESgpt为模板,扩增获得LoxPCMVgptIRESLoxP基因表达盒(约2.9kb),将其克隆入质粒pBUS10(含有MDVUS10区)的BalI位点,获得重组质粒pUSgptIRES(L);对重组质粒pUSgptIRES(L)进行测序分析,发现两同向的loxP位点正确插入到pUSgptIRES(L)中;将含有完整的GFP基因以及polyA尾的基因片段,连入pUSgptIRES(L)中,把gpt基因替换掉,从而获得重组质粒pUSGFPIRES(L)。将转移载体pUSGFPIRES(L)瞬时转染CHO细胞,可以观察到绿色荧光,说明GFP基因获得有效表达;将pUSGFPIRES(L)转染已感染MDVCVI988株的CEF细胞,可以筛选到表达绿色荧光蛋白的重组病毒;通过测定重组病毒在细胞上的生长曲线,发现重组病毒与亲本毒生长曲线相吻合。为进一步探讨MDV在体内的特性奠定基础,同时,为Cre/LoxP重组酶系统在MDV中的应用奠定基础。

条件基因打靶研究存在的主要问题及对策

基于Cre-loxP等位点特异性重组系统的条件基因打靶技术在解析基因功能和制备疾病小鼠模型方面发挥着极其重要的作用。但包括Cre重组酶转基因的表达模式不理想、重组效率存在差异、Cre重组酶的毒性等在内的Cre-loxP重组系统相关的缺陷以及条件基因打靶技术本身存在的问题,如遗传背景、育种策略、实验对照、基因代偿等方面的影响往往被忽略,严重影响基因功能和小鼠表型解析的准确性。针对这些问题,精细调控实现Cre重组酶的理想时空特异性表达、详尽地分析Cre重组酶的重组效率、降低Cre重组酶的毒性、遗传背景单一化、优化育种策略、设立严格实验对照、多基因联合条件基因打靶等诸多解决方案应予以采纳。

Cre/lox位点特异重组系统在转基因植物中的应用

位点特异重组系统由重组酶和相应的重组酶识别位点组成,通过两者间的相互作用,实现外源基因精确整合与切除等一系列遗传操作.主要可分为Cre/lox系统、FLP/frt系统、R/RS系统和Gin/gix系统.目前,研究最充分应用最广泛的位点特异重组系统为Cre/lox系统.此系统为位点特异重组系统家族中的一员,由38.5kDCre重组酶和34bplox位点组成,最早被应用于动物转基因研究,包括基因敲除、基因激活、基因易位等.近年来,随着研究的深入,Cre/lox系统被逐步应用到植物研究中,并在诸多领域取得重大进展.本文总结归纳了Cre/lox系统在定点整合、定点切除以及叶绿体转化等方面的最新研究成果,旨在为利用Cre/lox系统构建环境安全和高效表达的植物遗传转化体系提供参考.

vicK基因ATP结合位点对变异链球菌生物学功能的影响

目的构建变异链球菌UA159 vicK ATP缺失突变株,研究vicK基因ATP结合位点对变异链球菌生长、产酸耐酸、细胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)和生物膜形成等生物学功能的影响。方法quick change法构建vicK ATP缺失突变质粒,同时引入Sma lI,Sma lI插入kan基因盒(lox71-kan-lox66),建立vicK ATP缺失同源重组载体。所获载体转化变异链球菌,卡那霉素筛选阳性菌。pCrePA质粒转化阳性菌,30℃移除kan基因,37℃去除pCrePA,同源重组法获得无标记基因组vicK ATP缺失突变株。表达纯化VicK ATP缺失蛋白,并验证其ATP激酶活性。结果成功构建UA159 vicK ATP缺失突变株和补偿株。vicK ATP突变株生长速率和pH值下降均较野生株缓慢;实验株随致死性酸处理时间延长,生存率呈下降趋势,但突变株生存率较野生株高,即耐酸性增强;突变株EPS和生物膜形成较野生株明显减少。结论vicK基因ATP结合位点对变异链球菌的生长、产酸、酸耐受、EPS和生物膜形成起着重要调控作用。

肝细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

目的 构建在小鼠肝细胞中特异表达Cre重组酶的转基因小鼠。 方法 利用聚合酶链反应(PCR)获得小鼠肝细胞特异性启动子——白蛋白启动子,指导Cre重组酶在肝细胞中特异表达。通过受精卵显微注射的方法,将转基因载体导入小鼠受精卵中,获得转基因小鼠。利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转基因小鼠中Cre重组酶转录的组织特异性,并将转基因小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠进行杂交,利用PCR和Southern Blot进一步检测Cre重组酶在小鼠体内表达的组织特异性及其介导lox P位点之间发生重组的活性。 结果 获得了白蛋白启动子,构建了转基因载体pAlb-Cre。将转基因载体进行显微注射,共注射了837枚小鼠受精卵。PCR检测显示53只子代小鼠中有7只整合了Cre重组酶基因,Southern杂交结果证实共获得6只基因组上整合Cre重组酶基因的首建者小鼠。RT-PCR结果表明其中3只阳性小鼠的子代鼠在肝脏和睾丸中正确转录了外源基因。将在肝脏和睾丸中正确转录了外源基因的两只阳性鼠与Smad4条件基因打靶的小鼠杂交,通过PCR检测发现Cre转基因与Smad4条件基因打靶双阳性的子代鼠在肝脏中特异表达Cre重组酶,并能介导基因组中loxP序列间的基因重组,此结果通过Southern杂交得到了进一步证实。 结论 成功构建了在小鼠肝细胞中特异表达Cre重组酶?

携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体的构建与结构鉴定

目的构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化。方法去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒。先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒。同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5′端加入方向一致的LoxP序列。PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,最后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LoxP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒。结果PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同。结论成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体。