绵羊LPIN1基因的克隆和mRNA表达研究

本研究旨在克隆绵羊的LPIN1基因,分析其mRNA在2个不同脂尾型绵羊品种的7种脂肪组织中的发育性表达规律,以揭示该基因在绵羊脂肪代谢中的作用。利用RT-PCR技术克隆LPIN1基因,生物信息学方法分析Lipin1蛋白的理化性质和结构域;利用Real-time PCR技术检测广灵大尾羊和小尾寒羊2、4、6、8、10和12月龄共96个个体(每品种公、母各半)在大网膜、小网膜、肠系膜、腹膜后、皮下、肾周和尾部脂肪中的mRNA表达。结果表明,LPIN1基因CDS区长2 688bp,编码985个氨基酸。Lipin1是1种不稳定的亲水性蛋白,含有10个潜在的糖基化位点和88个磷酸化位点,但无跨膜域和信号肽。在其氨基酸序列的氨基端和羧基端各含有一段高度保守的序列,分别为Lipin-N和LNS2(Lipin/Ned1/Smp2)超家族特征序列。LPIN1mRNA在所研究的脂肪组织中都表达,其中肾周脂肪中表达最高,肠系膜脂肪中表达最低。品种、组织和月龄及其二阶互作对该基因的表达均有显著影响。LPIN1基因直接参与并间接调节脂肪代谢,对绵羊肉质性状的遗传改良具有重要意义。

6个猪群Lpin1基因多态性分析

试验采用PCR-RFLP方法检测了猪Lpin1基因第2外显子C93T突变在6个猪群中的多态性分布。结果表明,经TaqⅠ酶切后发现了CC、TC和TT 3种基因型。在6个猪群中C均为优势等位基因,CC为优势基因型。χ2检验发现,基因型分布在莱芜猪、沂蒙猪、杜洛克、大约克和长白猪群均达到了哈代—温伯格平衡（P〉0.05）,里岔猪未达到哈代—温伯格平衡（P〈0.05）;不同基因型在群体间的分布差异极显著（P〈0.01）。群体遗传特性分析表明,有效等位基因数在1.000~1.4808;多态信息含量里岔猪为0.2720,属于中度多态,其余猪群均低于0.25,为低度多态。

鸡Lpin1基因5'侧翼区微卫星变异的鉴定

为了掌握鸡Lpin1基因组内微卫星的分布特性,采用SSR hunter软件搜索位于鸡Lpin1基因组序列内的微卫星序列,并采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合克隆测序的方法对位于预测的启动子区域的复合微卫星进行了研究.结果表明,从鸡Lpin1基因组内搜索到9个微卫星,其分布频率为每5.5 kb 1个微卫星;对位于鸡Lpin1基因的5'侧翼区(预测的启动子区域附近)的复合微卫星(命名为CLP532)进行多态性研究,共检测到7个等位基因,其序列长度变异在25 bp.从6个鸡品种(固始鸡、河南斗鸡、卢氏鸡、白洛克、来航鸡、丝毛乌骨鸡)中检测到CLP532微卫星的6种等位基因.TFSEARCH软件预测CLP532微卫星长度的变异可引起鸡Lpin1基因转录因子结合位点的改变.研究结果显示,鸡Lpin1基因组内存在丰富的微卫星,CLP532微卫星具有丰富的多态,CLP532微卫星长度变异对鸡Lpin1基因的表达调控具有潜在重要的作用.

军牧1号白猪、杜洛克猪和藏猪的H-FABP和LPIN1基因多态性分布

为探索H-FABP和LPIN1基因在不同猪种中的多态性分布情况,应用PCR-RFLP技术检测了61头军牧1号白猪、51头杜洛克猪和51头藏猪H-FABP和LPIN1基因的多态性分布。结果发现,军牧1号白猪、杜洛克猪和藏猪在H-FABP基因的HinfⅠ多态性位点上均表现为单一的HH型,而HeaⅢ多态性位点上均表现出多态性,等位基因D的基因频率分别为0.1475、0.2255和0.7647,MspⅠ多态位点上,军牧1号白猪表现为单一的aa型,杜洛克猪和藏猪则表现为多态性,等位基因A的基因频率分别为0.6078和0.4609。在LPIN1基因的Eco88Ⅰ多态性位点上,杜洛克猪表现为单一的AA型,军牧1号白猪和藏猪表现为多态性,等位基因A的基因频率分别为0.4262和0.2059;在Bsh1236Ⅰ多态性位点上,杜洛克猪表现为单一的TT型,军牧1号白猪和藏猪则表现为多态性,等位基因T的基因频率分别为0.7459和0.2059。

鸡Lpin1基因3′-UTR遗传变异及其对miRNA结合位点的潜在效应

【目的】研究鸡Lpin1基因3′-UTR遗传变异/单倍型及其在品种间的分布,并预测这些变异对miRNA结合位点的潜在效应。【方法】根据鸡Lpin1基因组序列(GenBank登录号:NC_006090)设计一对特异性引物,采用PCR直接测序结合克隆测序的方法,进行鸡Lpin1基因3′-UTR及其邻近外显子在品种间的遗传变异/单倍型分析【。结果】①从6个品种中发现了8个变异位点,包含两个插入/缺失变异。这些变异均位于鸡Lpin1基因的3′-UTR,3′-UTR的变异频率为17SNPs/kb;②在鸡Lpin1基因3′-UTR区域,从固始鸡、卢氏绿壳蛋鸡中分别检测到7个变异位点,未检测到河南斗鸡品种内的变异;③用次要等位基因频率≥5%的6个变异位点(g.11A>T,g.77C>G,g.108_109delinsG,g.110_111delinsG,g.270A>G和g.348G>T)进行单倍型的构建和分析,从6个品种鸡中共检测到6种单倍型,其中P1和P4单倍型是群体的优势单倍型,频率均大于30%,河南斗鸡仅包含一种单倍型;④g.77C>G变异可引起多个miRNA结合位点的增加/丢失。【结论】鸡Lpin1基因3′-UTR具有丰富的变异,3′-UTR变异位点/单倍型在品种间的分布存在明显的差异。

LPIN1基因对水牛乳腺上皮细胞甘油三酯和脂肪酸合成的影响

本试验旨在通过构建腺病毒pDC316-LPIN1-eGFP载体并包装出相应的脂素腺病毒颗粒(Ad-LPIN1),探索LPIN1基因对水牛乳腺上皮细胞甘油酯和脂肪酸合成的影响。将Ad-LPIN1腺病毒颗粒感染水牛乳腺上皮细胞,通过实时荧光定量PCR、免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)检测LPIN1基因和lipin1蛋白的表达情况;通过油红O染色和甘油三酯测定甘油三酯;通过实时荧光定量PCR检测LIPN1基因对甘油三酯和脂肪酸合成相关基因表达的影响。本试验成功构建pDC316-LPIN1-eGFP载体并获得高质量的Ad-LPIN1腺病毒颗粒。Ad-LPIN1腺病毒颗粒感染水牛乳腺上皮细胞(MOI=50)后LPIN1基因mRNA相对上调>5000倍,差异极显著(P<0.01),lipin1蛋白表达量增多且主要在细胞核中表达。油红O染色结果显示,过表达LPIN1基因后细胞中的脂滴明显减少。甘油三酯测定结果显示,过表达LPIN1基因后细胞中甘油三酯含量下降,差异极显著(P<0.01)。实时荧光定量PCR检测表明,LPIN1基因过表达会使过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gama,PPARγ)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptor alpha,PPARα)、固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding transcription factor 1,SREBP1)基因表达量显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),同时使硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、长链脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase long chain family member 1,ACSL1)、乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl-CoA carboxylase alpha,ACACA)基因表达量极显著下降,分别下调至83.17%、51.30%、44.24%和41.18%(P<0.01)。以上结果表明,腺病毒高效介导LPIN1基因在水牛乳腺上皮细胞中表达,lipin1蛋白在细胞核中的表达量增加,lipin1蛋白作为转录共同激活因子下调ACACA、FASN、ACSL1和SCD基因的表达,从而抑制甘油三酯的合成。

LPIN1基因突变所致先天性肌病1例报道并文献复习

目的:报道1例LPIN1基因突变引起的先天性肌病,加强对常染色体隐性遗传的LPIN1基因突变相关表型的认识。方法:收集1例先天性肌病患者的临床表现、实验室检查、影像学表现、肌肉病理以及基因检测结果,结合文献复习进行分析讨论。结果:患者为男性儿童,自幼肢体肌力差。体格检查见肌张力低下,肢体肌力差,Gower(+)。血肌酸激酶升高。肌电图示肌源性损害。肌肉核磁见双侧大、小腿肌群广泛受累。肌肉病理见I型纤维占明显优势,约70%~80%。Sanger测序示LPIN1基因纯合突变(c.357_358insCT)。搜索既往报道的LPIN1基因相关肌病患者66例,所有患者均表现为横纹肌溶解(肌酸激酶显著增高、肌痛、血红蛋白尿),肌肉核磁表现无特异性,最常见合并心肌受累。结论:本病例系国内首次报道LPIN1基因突变所致的先天性肌病。肌肉活检有助于病理诊断,基因检测对遗传方式确定具有决定意义。