幽门螺杆菌Lpp20蛋白的生物信息学分析

目的:分析幽门螺杆菌Lpp20蛋白的主要化学和免疫学分子特征,为基因工程疫苗和诊断抗原的研究奠定基础。方法:根据Lpp20蛋白的氨基酸序列,应用生物信息学工具分析其蛋白序列,预测其信号肽、跨膜区、疏水性、二级结构、三级结构等性质。结果:Lpp20蛋白具有一段信号肽、脂蛋白信号肽酶切位点及脂盒模体,没有跨膜区,可能是一个外周膜蛋白;Lpp20蛋白的二级结构以α螺旋为主,其三级结构为一个致密的球状。结论:为基于幽门螺杆菌Lpp20蛋白的疫苗开发打下了基础。

幽门螺杆菌疫苗候选抗原lpp20基因的克隆表达及其纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)lpp20基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗保护性抗原奠定基础。方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入表达载体pET22b中,重组载体pET22b-Lpp20经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和W estern b lot鉴定。结果PCR扩增的lpp20基因长度为528bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达99%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的19.7%,纯化后,蛋白纯度达80%以上。W estern b lot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应。结论成功构建了lpp20表达载体pET22b-Lpp20,并在大肠杆菌中表达。

幽门螺杆菌Lpp20重组蛋白的表达、纯化及其免疫活性初步研究

目的表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)脂蛋白Lpp20基因的重组蛋白,并检测其免疫活性。方法应用PCR技术从H.pylori标准株26695染色体DNA中扩增出Lpp20的编码基因片段,将其克隆至表达载体pGEX-6P-2上,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21中表达并进行GST亲和层析纯化,用Western blot方法检测纯化产物重组Lpp20(recombinantLpp20,rLpp20)的免疫反应性。免疫C57BL/6小鼠后,以rLpp20为包被抗原建立间接ELISA法对免疫小鼠血清进行特异性抗体检测;ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4水平;MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应等指标以分析rLpp20的免疫活性。结果扩增的lpp20全长528 bp,与GenBank上公布的H.pylori 26695株lpp20序列作BLAST比较,结果完全一致;成功构建了pGEX-6P-2/Lpp20重组质粒,表达的rLpp20 M_r 43 000,纯化产物可被鼠抗H.pylori抗体识别;以rLpp20为包被抗原建立的间接ELISA法检测免疫小鼠血清,与对照组相比rLpp20免疫组可见阳性反应;rLpp20免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL-2和IL-4含量均明显升高;脾淋巴细胞增殖反应测定,rLpp20免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数也明显升高,与对照组有明显差异。结论rLpp20具有良好的免疫活性,在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答,为筛选高效的H.pylori疫苗抗原奠定了基础。

幽门螺杆菌lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达与纯化

目的 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达产物的纯化方法,为幽门螺杆菌基因工程疫苗的制备建立基础。方法 采用本研究室分离的HpMEL-HP27菌株提取染色体DNA,用PCR方法从HP染色体DNA上扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入到表达载体pMAL-c2X中,用重组质粒转化大肠杆菌(E.coli TB1)。采用IPTG进行诱导表达。用多糖树脂(amylose resin)作为填充料,制备层析柱,将可溶性菌体蛋白进行亲和层析。应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析。结果 融合蛋白的分子量约为60kDa,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的34％;纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。结论 与麦芽糖结合蛋白基因融合的lpp20基因在E.coli TB1中能够高效表达;用多糖树脂作为填充料,进行亲和层析的方法,具有良好的纯化效果。

利用生物信息学分析幽门螺杆菌Lpp20蛋的化学和免疫学分子特征

目的分析幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)郑州分离株MEL-HP27Lpp20蛋白的主要化学和免疫学分子特征,为Hp基因工程疫苗和诊断抗原的研究奠定基础。方法根据本研究室克隆的HpMEL-HP27lpp20基因的核苷酸序列推导出该基因表达产物(Lpp20)的氨基酸序列,应用生物信息学软件Omiga2.0、Anthepro4.5和GenBank数据库对Lpp20分子的主要化学特征和抗原活性进行分析。结果MEL-HP27Lpp20蛋白的氨基酸序列长度为175aa,Lpp20蛋白的分子量为19.122kDa,等电点为9.950,pH7.0时带电荷为9.035,280nm摩尔消光系数为12210,280nm吸光度为0.639,具有2个有抗原活性的结构域。结论MEL-HP27Lpp20蛋白分子具有典型抗原分子的结构特征,有希望成为新的Hp疫苗候选抗原。

基于Mimox工具分析幽门螺杆菌Lpp20蛋白模拟表位

目的利用Mimox软件分析幽门螺杆菌Lpp20蛋白模拟表位的性质。方法将源于噬菌体随机肽库筛选技术获得的6个Lpp20模拟表位输入Mimox网站,参数设为默认值,进行模拟表位的比对,寻找其共同序列并分析其性质。结果从ClustalW界面比对结果看,氨基酸D、A、S、G、L在模拟表位中出现的频率较高。通过统计学的方法推导出的共同序列为-[-W][PST][LDE]H[SDE][DM]ASG-[LT][YFW][-R]-,第2位置氨基酸W(50%),第7位置氨基酸D(67%),第8位置氨基酸A(50%),第9位置氨基酸S(50%),第12位置氨基酸L(50%)的出现频率较高。通过JalView界面推导出的共同序列为-WPLHSDASG-LYR-,保守性上第6位置S(分值6)、第7位置D(分值5)、第12位置L(分值5)比较高;特异性上第6位置S(分值2.067 059)、第12位置L(分值2.529 612)、第10位置G(分值1.805 491 4)、第3位置P(分值1.761 471 6)比较高;共同性上第7位置D(66%)、第8位置A(50%)、第9位置S(50%)、第10位置G(66%)比较高。结论结合噬菌体筛选技术和生物信息学Mimox工具对抗原模拟表位进行分析并获得较全面的表位信息,为进一步确定抗原表位及研制新型表位疫苗奠定基础。

幽门螺杆菌Lpp20抗原的原核表达及其临床应用

目的 获得原核重组表达的人幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）脂蛋白（lipoprotein20,Lpp20）,并将其用于Hp感染的血清学检测.方法 应用PCR技术从Hp标准株NCTC11639染色体DNA中扩增出Lpp20的编码基因片段,先进行T-A克隆和测序,并与Genbank公布的其它Hp菌株基因序列比较,再将目的 基因克隆至表达载体pGEX-4T-1上,在E.coli TOP10中进行表达并进行GST-亲和层析纯化,用Western blot方法检测纯化产物Lpp20与Hp感染患者血清的反应,以Lpp20为包被抗原建立ELISA法对143份血样进行检测,并以试剂盒为参照.结果 扩增的Lpp20基因全长528 bp（GenBank登录号为DQ106902）,与GebBank上公布的其它Hp菌株的序列相比较,核苷酸序列的同源性为96%～97%,推定氨基酸序列的同源性为98%～100%,表达的Lpp20融合蛋白分子量约为48 kDa,纯化产物可被Hp感染患者血清识别,以重组的Lpp20抗原建立的ELISA法检测Hp感染与试剂盒没有显著性差异.结论 重组Lpp20蛋白具有较好的抗原性,可用Hp感染的临床血清学检测及流行病学研究.

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1(+)-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1(+)-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1(+)-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1(+)-Lpp20真核表达重组载体。

幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20的研究进展

Lpp20是一种保守的幽门螺杆菌膜相关脂蛋白,他含有细菌脂蛋白的典型信号肽.近几年研究显示,Lpp20具有良好的免疫原性和免疫保护性.本文即对Lpp20的结构及其免疫原性和免疫保护性的研究进展作一综述.

幽门螺杆菌lpp20基因在食品级乳酸菌中的表达及免疫活性鉴定

目的:构建分泌表达幽门螺杆菌lpp20基因的重组乳酸乳球菌菌株,并鉴定其免疫活性,为研究安全高效的幽门螺杆菌口服疫苗奠定基础。方法:采用PCR法从幽门螺杆菌基因组DNA中扩增lpp20基因,将lpp20先与T载体(p MD19-T)连接,进而经双酶切与表达载体p NZ8149-SPusp45连接,用电穿孔法将重组质粒转入食品级乳酸乳球菌菌株NZ3900中,并用Nisin诱导Lpp20表达,表达产物通过Western blot法鉴定免疫活性。结果:lpp20基因的PCR扩增产物大小约为540 bp,重组质粒的酶切、PCR和测序鉴定结果符合预期;在菌体和培养基中均检出表达的Lpp20蛋白,重组表达的Lpp20蛋白相对分子质量约为20 000,且具有与小鼠抗幽门螺杆菌血清反应的免疫活性。结论:成功构建了能够分泌表达幽门螺杆菌Lpp20抗原的乳酸乳球菌菌株,该重组菌株在口服疫苗研究中具有应用潜力。

幽门螺杆菌lpp20基因的克隆与表达

目的 克隆及表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)lpp20基因,为探索高效的防治幽门螺杆菌感染的疫苗抗原和诊断抗原奠定基础。方法 用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出1pp20基因片段,将目的基因插入的表达载体pMAL-C2X中,用重组质粒转化大肠杆菌(E.coli TBI),并在E.coli TB1中进行表达。用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析。结果 用PCR方法扩增的lpp20基因长度约为540 bp;经酶切、PCR和测序分析,插入到载体的基因片段与文献报道的基因序列一致;SDS-PAGE的结果显示,目的基因表达产物的相对分子质量为18kDa,融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的34%。结论 本研究中构建的pMAL-C2X与lpp20基因重组质粒在E.coli TB1中能够高效表达目的基因。该重组子的构建为幽门螺杆菌lpp20基因的研究建立了重要的基础。

幽门螺杆菌Lpp20-IL2核酸疫苗免疫活性

【目的】观察pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫C57BL/6小鼠后所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,为研制高效、新型的幽门螺杆菌核酸疫苗提供实验依据。【方法】构建pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2重组载体,并转染HeLa细胞,用Western-blot观察鉴定其在真核细胞得到表达后免疫C57BL/6小鼠,ELISA间接法测定小鼠血清中抗Lpp20IgG抗体水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL4水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,免疫荧光组化法检测Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中的表达情况。【结果】成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2真核表达载体,且重组质粒能在HeLa细胞内有效表达目的蛋白;小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,8w后ELISA测定血清抗体A450值明显升高。核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL4含量明显升高。pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2和pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数明显高于空质粒组和PBS组。Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中能够有效表达。【结论】幽门螺杆菌Lpp20-IL2融合基因核酸疫苗和Lpp20单基因核酸疫苗均能刺激机体产生较强细胞免疫应答和体液免疫应答,且前者能诱导更强的细胞免疫应答。

幽门螺杆菌Lpp20融合蛋白的表达、标签切除及鉴定

目的:利用GST融合基因表达系统表达Lpp20-GST融合蛋白,并利用凝血酶切除GST标签。方法:IPTG诱导重组质粒Lpp20/pGEX-4T-1在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌后,发现Lpp20-GST融合蛋白以部分可溶性的形式表达。采用GST蛋白纯化系统对其纯化,得到Lpp20-GST融合蛋白,再用凝血酶进行GST标签的切除,所得产物进行Western Blot鉴定。结果:高效表达出Lpp20-GST融合蛋白的相对分子质量约4.5kDa,凝血酶成功切除了GST标签,Western Blot证实Lpp20蛋白能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别。结论:成功表达和纯化了重组Lpp20蛋白,为深入研究Lpp20的功能奠定了基础。

壳聚糖介导增强幽门螺杆菌Lpp20 DNA疫苗黏膜免疫效果的研究

目的 探讨壳聚糖包裹DNA疫苗黏膜免疫效果.方法 采用复凝聚法制备载幽门螺杆菌脂蛋白 Lpp20基因的壳聚糖（CS）纳米粒（NPs）,并对CS/DNA纳米粒的特质进行研究 用载基因壳聚糖纳米粒黏膜免疫（滴鼻和口服）小鼠,检测免疫小鼠的细胞和体液免疫水平.结果 裸质粒pcDNA3.1（＋）/Lpp20与CS/DNA NPs通过黏膜免疫均能诱导小鼠产生有效的免疫应答.CS/DNANPs滴鼻和口服免疫组诱导的抗体明显升高,与裸质粒组相比有明显差异（P＜0.05）,同时CS/DNANPs滴鼻和口服免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数及培养上清中IFN-γ和IL-4含量明显高于裸质粒组、壳聚糖组和PBS组,且滴鼻免疫组高于口服组.结论 壳聚糖纳米粒能增强pcDNA3.1（＋）/Lpp20核酸疫苗的黏膜免疫（滴鼻和口服免疫）效果 载Lpp20基因壳聚糖纳米粒滴鼻免疫比口服免疫能诱导更强的细胞和体液免疫应答.

幽门螺杆菌Lpp20核酸疫苗的构建及其免疫活性的初步研究

目的构建幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／Lpp20，并在HeLa细胞中进行表达。通过肌肉注射免疫C57BL／6小鼠，观察其诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平。方法用PCR法扩增Lpp20全基因，再将Lpp20基因克隆至pcDNA3．1（＋）真核细胞表达载体构建pcDNA3．1（＋）／Lpp20重组体，观察其在HeLa细胞中的表达。将核酸疫苗pcDNA3．1（＋）／Lpp20、对照空质粒pcDNA3．1（＋）及PBS分组通过肌肉注射免疫6周龄C57BL／6小鼠，隔2周免疫一次，共免疫4次。间接ELISA法测定小鼠血清中抗Lpp20IgG抗体水平，双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-1水平，MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应。通过PCR法检测小鼠肌细胞中Lpp20基因的存在。结果小鼠接种pcDNA3．1（＋）／Lpp20核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体，6周后ELISA测定血清抗体A450值为0．74，效价为1：1024。核酸疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后，培养上清中IFN-γ含量明显升高[（410．36±56．23）pg／m1]，与空质粒组[（25．26±10．85）pg／m1]之间差异有统计学意义（P〈0．01）。脾淋巴细胞增殖反应测定，核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后，刺激指数（2．37±0．22）明显高于空质粒组（1．53±0．47）和PBS组（1．20±0．13），P〈0．01。PCR检测Lpp20基因可在小鼠肌细胞中存在。结论成功构建了pcDNA3．1（＋）／Lpp20核酸疫苗，且其在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答。为进一步研究该疫苗的免疫保护作用提供实验依据。

柱上切除GST标签制备幽门螺杆菌Lpp20蛋白

目的表达幽门螺杆菌Lpp20-GST融合蛋白,获取切除GST标签的重组蛋白。方法采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组表达质粒Lpp20/pGEX-4T-1在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,收集菌体并采用反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌3种细胞破碎方法,表达产物在谷胱甘肽琼脂糖树脂4B柱上纯化,利用凝血酶切除GST标签,用鼠抗Lpp20单克隆抗体进行纯化产物western blot鉴定。结果高效表达出Lpp20-GST融合蛋白,相对分子质量约为4.5 kDa,产物以部分可溶性形式表达,凝血酶成功切除GST标签,纯化产物能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别。结论凝血酶柱上切除GST标签获得目的蛋白。

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌(Hp)Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1(+),转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1(+)-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。

幽门螺杆菌ureI和lpp20乳酸乳球菌表达载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI和外膜脂蛋白lpp20为目的基因,分别构建乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20,为H.pylori乳酸乳球菌活菌口服疫苗的研制奠定实验基础。方法根据幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI和脂蛋白Lpp20的全基因序列,利用PRIMER5.0各设计一对引物,进行PCR扩增,获得ureI和lpp20目的基因片段,将其与分泌表达载体pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体,并进行重组疫苗菌稳定性检测。结果以H.pylori标准株基因组DNA为模板分别扩增出特异的ureI和lpp20基因片段,大小分别为588 bp和528 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为588 bp和528 bp的H.pylori ureI和lpp20目的基因片段;并成功构建了幽门螺杆菌ureI及lpp20基因乳酸乳球菌表达重组载体。