罗非鱼无乳链球菌LrrG蛋白的原核表达及免疫原性分析

LrrG蛋白是无乳链球菌较保守的表面蛋白之一。为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性,本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列,设计特异性引物,扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因。分析表明,其ORF为2 361 bp,编码786个氨基酸,与人源无乳链球菌LrrG基因核苷酸序列的相似性高达98.48%。LrrG蛋白含有3个保守的LRR结构域,并可形成多个抗原表位。将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)/LrrG,E.coli BL21(DE3)22℃诱导表达6 h。SDS-PAGE显示,诱导表达蛋白的分子量为108.9 ku,并且该重组蛋白以可溶和包涵体2种形式存在。经His Bind亲和柱纯化及超滤管浓缩后,LrrG可溶蛋白浓度达3.40 mg/mL。鱼体注射免疫实验表明,LrrG可溶蛋白对罗非鱼的相对免疫保护率达69.28%,且免疫后4周的血清抗体滴度为1∶800。该研究为深入探讨无乳链球菌LrrG蛋白作为罗非鱼基因工程疫苗的潜在应用价值奠定了基础。

基于密码子优化策略的无乳链球菌表面蛋白LrrG的原核表达、纯化及免疫原性

为高效获得可溶性无乳链球菌表面蛋白(LrrG),通过密码子优化及构建LrrG基因优化后的pCzn1-LrrG重组表达载体,并转染至BL21(Plys)感受态细胞中,高效表达了无乳链球菌Streptococcus agalactiae(GBS)富含亮氨酸重复序列蛋白(LrrG)。根据大肠杆菌密码子偏好性,优化并人工合成LrrG全基因序列,经双酶切后插入至表达载体,将优化后的重组质粒pCzn1-LrrG转染至感受态细胞进行原核表达,经裂解和纯化后获得上清重组蛋白LrrG。结果表明:PCR扩增得到2286 bp的优化LrrG基因片段,构建的重组质粒pCzn1-LrrG经双酶切获得约4400 bp和2286 bp两条片段,与预期值相符;重组载体的测序结果与优化后的基因碱基序列比对结果完全一致,编码的氨基酸序列未发生突变;SDS-PAGE和Western blot鉴定结果显示,获得了相对分子质量约为108000的LrrG重组蛋白,与理论值相符,且优化后LrrG重组蛋白具有GBS抗原反应原性;通过亲和层析纯化LrrG上清蛋白后,发现优化后可溶性LrrG蛋白表达量较优化前提高了2.2~3.8倍;利用优化后的LrrG蛋白免疫罗非鱼后,发现其对罗非鱼抗GBS感染具有61.54%~69.23%的相对免疫保护率。研究表明,按照大肠杆菌密码子优化GBS表面蛋白LrrG,可有效提高其在大肠杆菌中的表达量,且优化后的LrrG重组蛋白仍然具有较好的免疫原性,本研究结果为基于LrrG基因工程疫苗的制备和应用提供了科学参考。

罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合蛋白免疫原性研究

为探究无乳链球菌LrrG(Leucine-rich repeat protein from GBS)和表面免疫原性蛋白Sip(surface immunogenic protein)串联表达的LrrG-Sip重组融合蛋白的免疫原性,该研究将原核表达的LrrG-Sip重组融合蛋白分别以0.5μg·g^(-1)(R1组)、1.0μg·g^(-1)(R2组)和1.5μg·g-1(R3组)每尾200μL腹腔注射免疫尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus),同时以Sip蛋白(S组)、LrrG蛋白(L组)以及PBS(P组)作为对照。2周后对所有免疫鱼体进行无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)人工攻毒,攻毒剂量为其半致死浓度(LD_(50):4.0×108CFU·mL^(-1))。结果显示LrrG-Sip重组融合蛋白R1组对尼罗罗非鱼的相对免疫保护率最高,达89.14%;且免疫后第14和第28天,该组鱼体血清抗体OD_(450nm)值分别达0.63和0.64,均显著高于单一蛋白对照组(S和L组)和PBS组(P<0.05);R1组鱼体血清过氧化物酶(POD)和碱性磷酸酶(AKP)活性在上述2个时间点也显著高于其他组(P<0.05);但溶菌酶(LZM)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性与其他组之间差异不显著(P>0.05)。初步表明LrrG-Sip重组融合蛋白具有良好的免疫原性,其免疫原性明显优于单个蛋白,且能有效减少免疫剂量。