基于U937-NF-κB-Luc细胞系的阿达木单抗生物学活性快速检测方法的建立及验证

目的建立基于U937-NF-κB-Luc细胞系的阿达木单抗生物学活性快速检测方法,并进行验证。方法以U937-NF-κB-Luc细胞系为效应细胞,通过荧光素酶发光原理建立阿达木单抗生物学活性检测方法,并优化方法的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)浓度(以160 ng/mL为初始浓度,进行2倍系列稀释,共10个稀释度)、抗体起始浓度(起始终浓度设为2000 ng/mL,进行2倍系列稀释,共20个稀释度)、抗体稀释倍数(1.5、2、3、4倍)、细胞接种量(8×10^(3)、2×10^(4)、4×10^(4)、6×10^(4)个/孔)、孵育时间(0.5、1、2、3 h),验证方法的专属性、准确性、精密性及线性范围。采用优化的方法及基于L929细胞的TNF-α中和活性法分别检测5批阿达木单抗的相对效价。结果阿达木单抗国际标准品的剂量-效应曲线呈典型的S型,且所得数据符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(x/C)^(B)]+D,R~2>0.99。确定最适TNF-α浓度为5 ng/mL,抗体起始浓度为800 ng/mL,抗体稀释倍数为2倍,细胞接种量为2×10^(4)个/孔,诱导时间为2 h。阿达木单抗等3种TNF-α靶点的治疗性单抗均可获得较好的剂量-效应曲线,其他非TNF-α靶点的治疗性单抗未呈现该曲线;效价理论值对数与其实测值对数的直线回归方程的斜率为1.037,相对偏倚均在±12%范围内;各效价样品的相对效价测定值的几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)均<20%;理论效价在64%~156%范围内,与检测值呈良好的线性关系,拟合直线回归方程为y=1.0374 x-0.0237,R~2=0.9984。两种方法检测5批阿达木单抗的相对效价检测结果差异无统计学意义(t=1.198,P=0.2651)。结论建立的基于U937-NF-κB-Luc细胞系的阿达木单抗生物学活性检测方法具有良好的专属性、准确性及精密性,且耗时短(仅需3 h),可作为阿达木单抗生物学活性的快速评价方法。

布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△S19-2的构建

通过构建自杀质粒,用定向同源重组的方法,把改造的萤火虫萤光素酶报告基因Luc NF+替换布鲁氏菌S19疫苗株Bp26基因部分片段,构建出布鲁氏菌Bp26基因缺失突变株△S19-1。在此基础上,用同样的方法,敲除△S19-1上的毒力基因Bmp18,构建成△S19-2。用PCR与萤光素酶报告基因在布鲁氏菌中表达的方法进行验证,结果表明Bp26基因与Bmp18基因改造成功,△S19-2具有Bp26基因分子标记、Bmp18毒力基因缺失的特点。

高密度脂蛋白亚类抗脂多糖作用的研究

目的:探讨不同的高密度脂蛋白(HDL)亚类抗脂多糖(LPS)作用。方法:转染NF-κB-luc报告质粒至HepG2细胞,分析HDL各亚类对经LPS刺激的转染细胞荧光素酶表达的影响、HDL亚类与转染细胞孵育对LPS诱导的荧光素酶表达的影响以及HDL与LPS孵育对LPS诱导的荧光素酶表达的影响;运用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术,分析HDL亚类与LPS孵育对LPS诱导的TNF-α mRNA表达的影响。结果:大颗粒HDL2孵育的细胞荧光素酶表达显著受到抑制;HDL3孵育的细胞荧光素酶表达略有降低;preβ1-HDL孵育的细胞荧光素酶表达未见改变;LPS-HDL2复合物刺激的细胞荧光素酶表达显著受到抑制;LPS-HDL2复合物刺激的细胞TNF-α mRNA的表达也显著降低。结论:成熟的大颗粒HDL2能够显著抑制LPS诱导的荧光素酶活性以及TNF-α mRNA的表达,表明HDL2具有较强的结合和中和LPS的能力。

严重创伤患者外周血清及内毒素对巨噬细胞核因子-κB活性的影响

目的探讨严重多发伤患者外周血清及内毒素对巨噬细胞核因子-κB(NF-κB)活性的影响及其意义。方法将带有荧光素酶报告基因的NF-κB重组质粒转染至小鼠巨噬细胞(RAW 264.7),24小时后用创伤或正常血清、创伤或正常血清+内毒素(LPS)刺激该细胞6小时。本研究分4组:20例正常人外周血清为正常血清组,26例严重多发伤患者伤后1、3、7天外周血清为创伤血清组,同时设正常血清+内毒素组,创伤血清+内毒素组。用荧光素酶报告基因检测试剂盒分析荧光素酶报告基因(LUC)的活性。结果各组荧光素酶报告基因活性的检测结果:创伤血清组、正常血清+LPS组和创伤血清+LPS组均显著高于正常血清组(P<0.01),创伤血清+LPS组也显著高于创伤血清组和正常血清+LPS组(P<0.01)。创伤血清组和创伤血清+内毒素组伤后1天的荧光素酶报告基因活性明显增高,伤后3天达高峰,伤后7天降低,但仍高于正常水平。创伤后并发器官损害病人的荧光素酶报告基因活性显著高于无器官损害者,其死亡率也较高。结论严重多发伤患者外周血清及内毒素刺激可明显增强巨噬细胞NF-κB活性。荧光素酶报告基因活性检测可早期预测严重多发伤后的脏器功能不全或MODS。