人呼吸道合胞病毒M2-1基因原核表达质粒的构建与表达

目的 构建人呼吸道合胞病毒 (hRSV)M2 1基因原核表达质粒载体 ,使其于原核细胞中表达。方法 利用Hep 2细胞培养hRSV ,提取感染细胞总RNA ,通过RT PCR扩增M2 1基因片段。目的片段与质粒pGEX 2T经EcoRI、XhoI双酶切后 ,连接、转化 ,筛选出阳性克隆。阳性克隆菌经诱导剂诱导后 ,表达M2 1融合蛋白。结果 成功地构建了M2 1基因原核表达质粒载体 ,实现了其于原核中的表达。结论 建立了hRSV基因M2 1原核表达载体 ,为进一步研究hRSV奠定基础。

人肝细胞癌中OY-TES-1和PKM2的表达及调控关系初探

目的:探讨癌-睾丸抗原OY-TES-1和丙酮酸激酶M2型(PKM2)在人肝细胞癌(HCC)中的表达,并分析OY-TES-1对PKM2表达的影响。方法:利用LinkedOmics数据库筛选OY-TES-1表达正相关基因集;使用DAVID数据库对OY-TES-1进行功能富集分析,了解HCC中OY-TES-1潜在的生物学功能,寻找功能相关基因;通过GEPIA数据库分析和实时荧光定量PCR(qPCR)实验检测,探讨OY-TES-1和功能相关基因在HCC中的表达及临床意义;干扰HCC细胞株中OY-TES-1的表达,qPCR和Western blotting检测OY-TES-1功能相关基因的表达变化。结果:LinkedOmics数据库筛选获得1001个与OY-TES-1表达正相关的基因集;功能富集结果显示,OY-TES-1可能通过PKM2参与HCC细胞多糖合成、脂代谢、碳水化合物代谢等信号通路。GEPIA数据库分析显示,HCC组织中OY-TES-1和PKM2的表达显著高于正常肝组织,两者表达呈正相关关系(r=0.3;P<0.001);qRT-PCR证实OY-TES-1(癌组织:0.58±0.95 vs.癌旁组织:0.36±0.61,P<0.05)和PKM2(癌组织:0.14±0.17 vs.癌旁组织:0.08±0.14,P<0.05)在HCC组织中均为高表达,两者的表达呈正相关关系(r=0.482,P<0.001);尚未发现OY-TES-1和PKM2的表达与HCC患者临床参数相关。在HepG2和BEL-7404细胞株中干扰OY-TES-1表达,PKM2的mRNA和蛋白表达随之明显下调。结论:OY-TES-1和PKM2均高表达于HCC,且两者具有较强的表达相关性;HCC中OY-TES-1能够影响PKM2的表达。

骨髓间充质干细胞外泌体介导miR-124-1对小胶质细胞M2型极化调控的影响

目的·探讨过表达miR-124-1基因的骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)外泌体(exosomes,Exo)对小胶质细胞(microglia,MG)M2型极化调控的影响。方法·分离、培养鼠BMMSCs,提取其Exo(BMMSCs-Exo),并分别对BMMSCs及BMMSCs-Exo行流式细胞术、透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)与蛋白质印迹(Western blotting)检测及鉴定。合成miR-124-1基因,构建其慢病毒载体,观测过表达miR-124-1基因的BMMSCs及其Exo的miR-124-1基因的表达变化。将过表达miR-124-1基因的BMMSCs-Exo(BMMSCs-Exo+miR-124-1,Exo/124-1)与经脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)活化的HAPI小胶质细胞株(HAPI细胞)共培养。分别收集Exo组与Exo/124-1组细胞。用仅含LPS培养基培养的HAPI细胞(LPS组)与未处理的HAPI细胞(正常组)作对照。使用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和Western blotting分别检测其M1型分子[白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]和M2型分子(CD206、IL-10)的mRNA及其蛋白的表达变化。结果·成功分离、培养、鉴定了BMMSCs及BMMSCs-Exo。Exo/124-1明显表达miR-124-1基因。qPCR和Western blotting检测证实,BMMSCs-Exo能携带miR-124-1基因,其明显下调了HAPI细胞的IL-6(与正常组和LPS组比较,在基因水平分别下调了55.71%、73.04%,在蛋白水平分别为52.32%、76.95%)和TNF-α(与正常组和LPS组比较,在基因水平分别下调了51.95%、68.91%,在蛋白水平分别为52.14%、77.47%)。并且Exo/124-1上调了HAPI细胞的CD206(与正常组和LPS组比较,在基因水平分别上调了46.90%、76.99%,在蛋白水平分别为65.13%、85.11%)和IL-10(与正常组和LPS组比较,在基因水平分别上调了43.09%、72.36%,在蛋白水平分别为55.19%、78.18%)的表达。结论·BMMSCs-Exo可介导miR-124-1调控HAPI细胞向M2型极化。

人呼吸道合胞病毒转录调节基因转染肺腺癌细胞系的研究

目的 获得稳定表达人呼吸道合胞病毒(h RSV) M2 - 1基因的人肺腺癌细胞系。方法 通过基因重组法构建h RSV M2 - 1基因真核表达载体,用脂质体将其转染人肺腺癌PAa和A5 4 9细胞,经G4 18筛选获得阳性表达细胞株,并用逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)和Western Blot进行验证。结果 得到了约6 5 0 bp的基因插入片段,DNA测序表明该基因高度保守。筛选出了稳定高量表达M2 - 1基因的PAa和A5 4 9细胞,并被证实有M2 - 1蛋白表达。结论 获得了稳定表达h RSV M2 - 1蛋白的PAa和A5 4

人呼吸道合胞病毒转录调节基因转染PAa和A549肺腺癌细胞系

目的探讨人呼吸道合胞病毒(hRSV)对肺癌细胞的影响。方法构建其转录调控因子M2-1基因真核表达质粒pXJ-41/M2-1,用DNA测序、酶切、PCR等方法鉴定基因重组情况。结果DNA测序表明该基因具有高度保守性;经脂质体转染、以-βactin为参照进行RT-PCR,筛选出了高效稳定表达M2-1基因的人肺腺癌PAa和A549细胞株,并经Westernblot验证有M2-1蛋白的表达。结论为进一步探讨M2-1基因在肺癌发生发展中的作用打下基础。