羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR方法的建立

为了寻找一种能够鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株与其他布氏杆菌菌株的双重实时荧光定量PCR检测方法。针对布氏杆菌菌株的16S rRNA和Bp26基因,各设计一套引物和探针,并优化反应体系和反应程序。以布氏杆菌A19、S2、M5-90和M5-90△26四种疫苗株以及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的特异性。克隆构建PCR_16S rRNA_Bp26标准品,通过倍比稀释进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的灵敏度。使用该方法与虎红平板凝集试验、试管凝集试验进行检测结果对比,评价该方法的可行性。结果显示,本方法特异性好,布氏杆菌A19、S2、M5-90三种疫苗株均同时出现Bp26基因和16S rRNA基因的扩增,布氏杆菌M5-90△26疫苗株只出现16S rRNA基因的扩增,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌均未出现扩增曲线。该方法建立的16S rRNA基因序列扩增通道和Bp26基因序列扩增通道对标准品的最低检测限均达5 copies/μL。该方法对临床样本的检测结果与虎红平板凝集试验、试管凝集试验检测结果符合率较高,说明建立的羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR检测方法可用于临床的检测,为鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株免疫与布氏杆菌野毒株感染提供一种可行的检测方法。

羊种布鲁氏菌M5-90 omp31蛋白原核表达

克隆、测序布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白基因OMP31,原核表达OMP31并对其检测。从羊种布鲁氏菌M5-90中PCR获得OMP31基因,连接到pBS-T克隆质粒并测序;将测序正确的基因片段克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a,进行SDS-PAGE,而后Western-blot检测。结果M5-90疫苗株的OMP31基因序列与羊种布鲁氏菌参考株16M的同源性为99.03%;外膜蛋白基因OMP31在大肠杆菌表达后能够被Western-blot检测到。结论:表达的布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白OMP31可以被布鲁氏菌特异性血清识别,表现出良好的抗原性,为以后实验室诊断和疫苗的研究做好坚实的上游工作。

布鲁氏菌病活疫苗(M5-90株)免疫绵羊试验

为掌握布鲁氏菌病活疫苗(M5-90株)免疫后的绵羊抗体水平、消长情况和不良反应发生情况,选择育肥羊和怀孕母羊各100只,分别用皮下注射免疫和点眼免疫法,开展了3个月的跟踪观察和定期检测。结果表明:布鲁氏菌病活疫苗(M5-90株)对育肥羊注射免疫后15 d的平板凝集抗体转阳率达100.0%,90 d降至22.7%;点眼免疫后15 d的平板凝集抗体转阳率达85.4%,90 d日降至0;个别3月龄以下育肥羊对注射免疫和点眼免疫均会发生一定程度不良反应,甚至死亡。活疫苗(M5-90株)对怀孕母羊皮下注射免疫后15 d的平板凝集抗体转阳率达100%,90 d降至14%;点眼免疫后15 d的平板凝集抗体转阳率达95.9%,90 d降至6.4%;注射免疫和点眼免疫均能造成一定比例的母羊流产和其他不良反应。因此,布鲁氏菌病活疫苗(M5-90株)不宜用于3月龄以下羔羊和怀孕母羊的免疫。

羊种布氏杆菌M5-90菌苗对绵羊附睾种布氏杆菌病预防效果的病理形态学观察

由Br. ovis菌引起的公羊附睾炎可导致公羊生育能力下降、种用年限缩短、商品价值降低。据报道,我国从国外引进的种公羊中,已有由Br. ovis引起的布氏杆菌病的发生。但我国尚无针对Br.

原核表达山羊布氏杆菌M5-90VirB12蛋白及其在检测中的初步应用

为建立山羊布氏杆菌(Brucellar melitensis)血清学检测方法,本实验克隆了B.melitensis M5-90疫苗株的virB12基因,并表达了相应蛋白。经SDS-PAGE和western blot鉴定,重组VirB12蛋白分质量约为25ku,具有较好的抗原性。以纯化的VirB12重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,并检测90份B.melitensis临床血清样品,检测结果与试剂盒及虎红平板凝集试验的检测结果符合率均为91.7%,结果表明,VirB12重组蛋白作为包被抗原可用于B.melitensis感染的血清检测,为进一步建立B.melitensis M5-90virB12缺失标记疫苗的鉴别检测提供方法。

布氏杆菌M_5-90弱毒菌苗对绵羊、山羊三年免疫期试验

用布氏杆菌M_s-90弱毒菌苗皮下10亿,喷鼻1亿、5亿或滴鼻10亿活菌免疫山羊后三年,各免疫组均100％保扩。用10亿活菌滴鼻免疫绵羊,由于随机编入妊娠羊占4/5,效果不好(保护率为零)。10亿活菌苗对绵羊喷鼻免疫,间隔二年后应加强免疫。10亿活菌皮下接种绵羊,三年免疫期的保护率为66.60％。

布鲁氏菌病疫苗免疫评估与野毒感染区分试验

为评估布鲁氏菌基因缺失活疫苗(M5-90△26株)的安全性和免疫效果,在华池县选取阴性、阳性羊群各一群,以腿部皮下注射的方式免疫接种布鲁氏菌基因缺失活疫苗(M5-90△26株),免疫接种后30 d、90 d、120 d、150 d、180 d分别采集血清样品,用虎红平板凝集试验和试管凝集试验开展免疫效果评估,统计抗体转阳率、转阴率等指标。结果显示,M5-90△26株免疫接种30d后抗体达到峰值,以后逐渐下降,免疫90d后转阴率在80%以上,说明该疫苗具有免疫效果好、保护率高、转阴快等优点。布鲁氏菌基因缺失活疫苗(M5-90△26株)中敲除bp26基因,用布鲁氏菌病LPS和BP26蛋白ELISA抗体检测试剂盒可以对疫苗免疫阳性和野毒感染进行区分,能够为布鲁氏菌病检疫、净化提供依据,为华池县布鲁氏菌病防控提供更多参考。

布鲁氏菌疫苗免疫抗体水平消长规律研究

本研究旨在评估不同布鲁氏菌疫苗株(A19、S2和M5)及免疫程序对牛羊的免疫效果和抗体消长规律,以优化布鲁氏菌病的疫苗免疫策略。选取免疫背景清晰的牛犊和羊只,分别采用A19疫苗注射、S2疫苗灌服和M5疫苗注射的方法进行免疫。免疫后定期采集血清样本,通过虎红平板凝集试验检测抗体阳性率。结果表明,A19疫苗在初次免疫后30 d抗体转阳率最高,加强免疫可维持较长时间阳性率。S2和M5疫苗在免疫后15~30 d达到抗体阳性高峰,注射组阳性率显著高于灌服组,且S2疫苗的阳性持续时间较长。统计分析显示,不同疫苗株和免疫方式对抗体阳性率和持续时间有显著影响。研究结果为制定布鲁氏菌病的疫苗免疫接种程序提供了科学依据,指出A19疫苗加强免疫的重要性,以及注射免疫方式相较于灌服在提高免疫效果和延长保护时间上的优势。

马耳它布氏杆菌bp26基因缺失株的构建及鉴定

为了建立马耳他布氏杆菌M5-90株弱毒疫苗株与野生株的鉴别诊断,本研究以bp26基因作为重组靶位点,以M5-90为亲本,利用bp26基因ORF外侧序列作为同源序列,将卡那霉素抗性基因(Kanr)整合到细菌基因组中,双交叉重组阳性菌株,经SDS-PAGE和western blot试验表明迁移率约为29ku的BP26蛋白在亲本菌中表达并可被鼠抗BP26高免血清识别,而突变株M5-90-26反应结果为阴性,表明BP26蛋白在突变疫苗株M5-90-26中未表达。M5-90-26具备从血清学角度区分M5-90-26免疫与野生型布氏杆菌感染,对布氏杆菌病防制、监测及净化具有重要的意义。

不同毒力马耳他种布鲁氏菌体内外诱导细胞凋亡的研究

为探究不同毒力马耳他种布鲁氏菌能否在体内外诱导凋亡以及诱导凋亡程度的差异,本研究将M28(强毒株)和M5-90(疫苗株)以MOI=100感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,利用激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测凋亡产物caspase3/7。结果显示:M5-90和M28在体外细胞水平均能够诱导RAW264.7细胞凋亡,且M5-90促进细胞凋亡能力高于M28。然后将M28和M5-90以1×10~6 cfu的剂量接种BALB/c小鼠,分别在接种后3 d、7 d和42 d迫杀小鼠,取小鼠脾脏组织制备切片,经HE染色后进行形态学观察,利用透射电镜观察并通过Tunel法检测细胞凋亡。结果显示M5-90和M28感染后均可诱导小鼠脾脏细胞凋亡,凋亡细胞主要为T淋巴细胞。本研究为布鲁氏菌诱导宿主细胞凋亡和布鲁氏菌致病机理研究奠定了基础。