鱼腥草多糖对MA104和MARC145细胞活力影响的比较研究

研究鱼腥草多糖(houttuynia cordata polysaccharide,HCP)对MA104和MARC145细胞活力的影响,筛选梯度浓度的鱼腥草多糖对MA104和MARC145细胞促生长最佳浓度剂量范围和毒性剂量。通过水提醇沉法提取HCP,得糖率为8.18%;分别采用MTT法和细胞平板计数法绘制MA104和MARC145细胞的生长曲线;应用MTT法检测梯度浓度HCP对MA104和MARC145细胞活力的影响。结果表明,50 mg/mL HCP对细胞活力有抑制作用(P<0.05),0.05~5 mg/mL HCP对细胞活力有促进作用(P<0.05),0~0.005 mg/mL HCP对细胞活力无显著影响(P>0.05)。结果表明,HCP(0~5 mg/mL)对MA104和MARC145细胞无毒性作用。

牛轮状病毒的分离及其RT-PCR鉴定

采用MA104细胞从疑似轮状病毒腹泻犊牛粪样中进行轮状病毒分离,盲传4代后接种细胞出现明显细胞病变(CPE),对分离病毒进行核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳条带为4∶2∶3∶2型,具备典型A群轮状病毒特征。依据NCBI等登录的牛轮状病毒的VP1基因序列设计一对引物,对其VP1基因进行克隆及序列分析,结果分离毒与国外牛轮状病毒分离株RF的核苷酸同源性为98.9%,与UK的核苷酸同源性为91.5%,证明分离毒株是一株牛轮状病毒。

大蒜素体外抗猴甲型轮状病毒的研究

目的研究大蒜素体外抗猴甲型轮状病毒(SA11)的作用。方法通过病毒滴度测定来确定大蒜素能否抗SA11以及最佳浓度。结果大蒜素对MA104细胞的最大无毒浓度为100 mg/ml,病毒滴度测定可以得出,50 mg/ml的大蒜素可以抑制SA11感染的MA104细胞出现细胞病变效应(CPE)。结论一定浓度的大蒜素在体外有抗SA11的作用。

秋泻灵和儿泻停颗粒在体外传代细胞上抗轮状病毒的研究

目的:研究比较中药制剂秋泻灵和儿泻停颗粒体外传代细胞上抗轮状病毒的作用,为秋泻灵的进一步动物试验及临床应用提供一定的实验依据。方法:颗粒状药物用PBS溶解过滤后作为原液,稀释至不同浓度,用于以下实验:1不同浓度的药物直接于4℃与SA11轮状病毒作用1 h后,接种到轮状病毒敏感的恒河猴肾细胞MA104上,评估药物对病毒的灭活作用;2用不同浓度的药物作用细胞1 h,再接种SA11,评估药物阻止病毒入侵细胞的作用;3先用轮状病毒SA11株感染MA104细胞,然后测定不同浓度的药物抑制病毒增殖的作用。结果:秋泻灵和儿泻停的半数细胞毒性浓度(CC50)分别为3.62和2.60 mg/m L;药物浓度为1×10^(-4)~10 mg/m L时,二者对轮状病毒有灭活作用;在阻止病毒入侵细胞的实验中,儿泻停在较高浓度时有效,而秋泻灵在低浓度时有效;在清除已感染MA104细胞的SA11轮状病毒时,二者在适宜浓度时有微弱作用。结论:秋泻灵和儿泻停在适宜浓度时对轮状病毒SA11有灭活作用;二者对阻止SA11轮状病毒入侵MA104细胞显示了一定的的保护作用;本次试验条件下,二者在一定浓度下显示了清除已感染MA104细胞的SA11轮状病毒的微弱作用。

靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白shRNA慢病毒干扰质粒的构建及鉴定

目的构建靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)的shRNA慢病毒干扰质粒,并对其进行鉴定。方法根据Gen Bank中登录的PTB的基因序列设计并合成2条靶向MA104细胞PTB基因的shRNA干扰序列(shPTB1、shPTB2)和1条阴性对照序列(shControl),分别插入载体p LVshRNA-EGFP(2A)Puro后,构建慢病毒重组质粒;利用HEK293Ta细胞包装针对PTB基因的shRNA的重组慢病毒颗粒;感染MA104细胞后,经Resl-time PCR、免疫荧光和Western blot法分别检测MA104细胞中PTB基因的转录和蛋白表达水平。结果 PCR及测序鉴定证明3种重组慢病毒质粒构建正确。3种重组慢病毒质粒转染HEK293Ta细胞48 h后,均可见绿色荧光表达,3组细胞的病毒滴度均为2×106 TU/ml。3种重组慢病毒感染MA104细胞48 h后均可见绿色荧光表达。经嘌呤霉素加压筛选后,p LVshPTB1-EGFP-2A和p LVshPTB2-EGFP-2A组MA104细胞仅有少量细胞于细胞核中表达,p LVshPTB1-EGFP-2A组MA104细胞中PTB基因转录及蛋白表达的水平均低于p LVshPTB2-EGFP-2A组。结论成功构建了靶向MA104细胞PTB蛋白的shRNA重组慢病毒,shRNA序列可成功下调PTB在MA104细胞中的表达,为PTB在RV增殖过程中调控作用的研究奠定了基础。

对两株NSP3区插入外源基因的重组轮状病毒遗传稳定性的研究

目的分析2株插入和表达外源基因的重组轮状病毒rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD在MA104细胞上连续传代增殖的遗传稳定性。方法将2株重组轮状病毒滴度测定后, 按照MOI0.01传至P2代, 随后按1∶100稀释并活化上一代病毒裂解液, 连续18代(P20)感染MA104细胞, 用间接免疫荧光法测定P1, P5, P10, P15, P20代细胞裂解液病毒滴度, 进行RT-PCR鉴定以及dsRNA-PAGE银染实验, 并检测rLLR/NSP3-NLuc的荧光素酶活性。结果重组轮状病毒rLLR/NSP3-NLuc在20代内均未发现插入片段丢失, 重组病毒滴度为3.85~5.16×10^(6) FFU/ml, 各代次均有较强的荧光素酶信号。重组轮状病毒rLLR/NSP3-CoV2/RBD在第6代出现了插入片段的丢失, 该重组病毒前5代的感染性滴度为:2.6~3.36×10^(6) FFU/ml。结论 NSP3基因末端插入582 bp NLuc的重组轮状病毒具有很好的遗传稳定性, 而NSP3基因末端插入885 bp RBD的重组轮状病毒仅在前5代稳定, 提示重组轮状病毒NSP3基因末端可以插入和表达外源基因, 但其稳定性需要更深入研究。

四株猪轮状病毒蚀斑特性试验

从江苏省自然腹泻病猪粪便中分离获得的四株猪轮状病毒,都能在MA104单层细胞上形成蚀斑,其中三株形成大小不同的蚀斑,另一株仅形成小蚀斑。蚀斑试验培养瓶,在37℃中培养五天,大蚀斑直径达3—6毫米,小蚀斑达1—2毫米。在灯光下,可见蚀斑呈云块状;在低倍显微镜下,蚀斑呈深色的细胞团块;用10％福尔马林结晶紫液固定染色,活细胞层染成深紫色而病毒感染的细胞脱落而成蚀斑。

多细胞株微量培养法在病毒性脑炎、脑膜炎患儿病原学检测的应用研究

目的探讨多细胞株微量培养法在病毒性脑炎、脑膜炎病原学检测中的应用价值。方法将脑脊液(CSF)标本过滤除菌后分别接种于含有青霉素和链霉素微量细胞培养板单层细胞上,每份标本平行接种8株细胞:MA104、MDCK、HEL、HEK293、Vero、Hep-2、Hela和BHK-21。静置培养,获得稳定的病毒株。以肠道病毒(EV)组合血清鉴定引起病毒性脑炎、脑膜炎的常见病毒类型。结果 126份病毒性脑炎、脑膜炎患儿CSF标本82份分离到病毒,阳性率63.0%,其中MA104阳性率为57.1%,MDCK阳性率为19.8%,HEL阳性率为11.9%,HEK阳性率为7.1%,Vero阳性率为6.3%,Hep-2阳性率为4.8%,Hela阳性率为4.0%,BHK-21阳性率为2.4%。病变细胞经血清学鉴定,78例鉴定出病毒株,鉴定率为92.8%,这些病毒中EV所占比例较高,为69.2%;ADV占11.5%,HSV-Ⅰ占5.1%,HSV-Ⅱ占6.4%;CMV占5.1%,INF占2.6%。结论 MA104细胞是分离CSF中病毒较敏感的细胞,可以作CSF中病原分离的首选细胞;联合多株细胞可提高细胞病变检出率。多株细胞微孔板培养法分离CSF病毒具有推广应用价值。