MAGE-1、MAGE-3基因在胃癌和胃活检组织中的表达及意义

目的 :检测黑色素瘤抗原基因 1、 3(MAGE 1和MAGE 3)在胃癌中的表达 ,探索其在胃癌免疫治疗中的应用价值。方法 :采用RT PCR法 ,对 36例胃癌患者的癌组织和相应的癌旁“正常”黏膜 ,以及 37例慢性胃炎患者的胃镜活检组织中 ,MAGE 1和MAGE 3基因的表达进行研究 ,并对RT PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA测序验证。结果 :36例胃癌组织中 ,MAGE 1基因的表达阳性率为 72 .2 2 % (2 6 / 36 ) ,MAGE 3基因的表达阳性率为 6 9.4 4 % (2 5 / 36 )。MAGE 1、MAGE 3的表达均为阳性者为 5 2 .78% (19/ 36 )。癌旁“正常”黏膜中 ,MAGE 1、MAGE 3基因的表达阳性率分别为 4 7.2 2 % (17/ 36 )和4 4 .4 4 % (16 / 36 ) ;MAGE 1、MAGE 3基因表达双阳性者为 30 .5 5 % (11/ 36 )。在 37例胃慢性炎症患者中 ,MAGE 1、MAGE 3基因的表达阳性率 ,分别为 2 9.73% (11/ 37)和 2 7.0 3% (10 /37) ;MAGE 1、MAGE 3基因的表达双阳性者为 8.1% (3/ 37)。胃癌组织中 ,MAGE 1和MAGE 3基因表达阳性率均高于癌旁和胃慢性炎症患者 ;在肿瘤组织中的表达阳性率与肿瘤浸润的深度和分化程度有关 (P <0 .0 5 ) ;而与临床病理分期及淋巴结转移无关 (P >0 .0 5 )。结论 :基于MAGE 1和MAGE 3基因在胃癌中的高表达率 ,可利用这两种蛋白作为靶?

人肿瘤特异抗原MAGE-3基因疫苗的构建和表达

目的 克隆肿瘤特异性共享抗原mage 3基因 ,制备基于α 病毒复制酶的高效黑色素瘤特异性基因疫苗。方法 用RT PCR方法从黑色素瘤细胞系LB3 73中制备mage 3基因 ,以含α 病毒复制酶的哺乳细胞高效表达质粒pSMART2a为载体 ,构建重组DNA疫苗。重组子用载体中的T7和T3启动子序列为测序引物进行自动测序。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化 2 93细胞 ,用免疫印迹法和免疫组化法鉴定转化细胞中mage 3蛋白的表达。结果 正确构建了mage 3 pSMART2a重组质粒 ,并且在转化此质粒的 2 93细胞中检测出了mage 3蛋白的表达。结论 此重组mage 3 pSMART2a质粒可以作为肿瘤特异的DNA疫苗 ,可进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及相关免疫学效应研究。

人黑色素瘤抗原MAGE-3基因的克隆与表达

目的克隆人黑色素瘤特异抗原 MAGE- 3基因 ,以制备肿瘤 DNA疫苗。方法用 RT- PCR方法制备 MAGE-3基因 ,以哺乳细胞高效表达质粒 p CI- neo为载体 ,构建重组 DNA疫苗。重组体用载体上的通用引物为测序引物 ,鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化 2 93细胞 ,用免疫印迹法鉴定转化细胞中 MAGE- 3基因的表达。结果正确构建了 MAGE- 3/p CI- neo重组质粒 ,并且在转化细胞中检测出了 MAGE- 3的表达。结论成功地构建了重组 MAGE- 3/p CI- neo肿瘤核酸疫苗 。

MAGE-3 DNA疫苗的构建及其免疫效果的观察

通过RT PCR方法扩增MAGE 3cDNA ,以pcDNA3 1+为载体 ,构建重组表达质粒pcDNA3 1 MAGE 3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞 ,经RT PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE 3的表达。以 10 0 μg质粒剂量肌肉注射接种小鼠 ,间隔 10天 ,共 3次 ,以空载体和PBS为对照。结果 ,重组质粒免疫的小鼠 ,其脾淋巴细胞对MAGE 3阳性靶细胞的杀伤活性为 51 0 8± 7 41% ,与空载体组 (8 44± 1 89% )及PBS组 (5 76± 1 75% )相比 ,差异有显著性 (P <0 0 1) ,而对MAGE 3阴性靶细胞的杀伤活性分别为 8 2 1± 1 65% ,7 68± 1 56%和 5 13±1 42 % ,其差异无显著性 ;MAGE 3DNA疫苗组免疫血清 1∶15稀释时能检测到抗MAGE 3抗体 ,脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN γ、IL 2水平明显升高 ,外周血中CD4+、CD8+T细胞也提高 ,小鼠肿瘤的生长速度明显减慢 ,与对照组相比 ,差异显著 (P <0 0 1)。说明MAGE

黑色素瘤抗原基因MAGE-1、MAGE-3和抑癌基因p53在肺癌中表达的研究

目的:分析肺癌组织MAGE-1和MAGE-3基因以及p53基因表达及其相互关系。方法:取肺癌组织标本30例,另取癌周组织作为对照。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测MAGE-1和MAGE-3基因以及p53基因的表达。结果:MAGE-1,MAGE-3在肺癌中有较高表达,MAGE-3的表达高于MAGE-1的表达。p53在肺癌中表达较低,在正常组织中表达较高;MAGE-1在肺腺癌中表达较鳞癌高,MAGE-3在肺鳞癌中表达较高;MAGE-1,MAGE-3的表达可能与肿瘤分化程度无关;p53在小细胞肺癌中的表达有待进一步研究;p53与MAGE在体内表达成负相关。结论:MAGE-1、MAGE-3和p53在肺癌组织与正常组织中有不同的表达,MAGE-1、MAGE-3的表达与病理类型有关,与肿瘤分化无关。

MAGE-3基因的表达检测和重组MAGE抗原的制备及其应用

目的克隆MAGE-3基因并检测其在人食管癌组织中的表达情况；重组表达MAGE-1和MAGE-3抗原，用于食管癌的治疗性蛋白疫苗的免疫原性研究。方法RT-PCR法检测了MAGE-3在人食管癌组织中的表达情况。采 用DNA重组技术将MAGE-1和MAGE-3全长cDNA 克隆至pET30a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE 和 wes-tern blot鉴定后，制备其可溶性蛋白，研究其对人T细胞增殖能力的影响。结果MAGE-3基因 在食管癌组织中的表达率为50%（15/30）；在30例相应癌旁正常组织中未见表达。成功获得了MAGE-1和MAGE-3可溶性蛋白；人 T细胞能够对自身抗原递呈细胞加工处理的MAGE-1和MAGE-3蛋白产生应答。结论MAGE-1和MAGE-3蛋白可能是用于食管癌免疫治疗的免疫原性较强的靶抗原。

MAGE-3基因稳定转染的HHCC细胞系的建立及其mRNA的表达

目的:构建肿瘤抗原MAGE-3基因的真核表达载体,建立MAGE-3基因稳定转染的人肝细胞癌细胞系(humanhepatocellularcarcinomacellline,HHCC)。方法:利用分子生物学方法,构建带有MAGE-3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-3,经脂质体法转染HHCC后,用G418筛选阳性克隆。在荧光显微镜下观察HHCC中EGFP的表达,用RT-PCR法检测HHCC中MAGE-3mRNA的表达。结果:成功地构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-3。以其转染HHCC后,经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3mRNA转录和EGFP的表达。结论:建立了1株可稳定转染MAGE-3基因的肝细胞癌HHCC,为进一步应用该基因进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据。

MAGE-3基因的表达、纯化及其抗血清的制备

【目的】构建MAGE-3的原核表达质粒,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体。【方法】利用RT- PCR方法扩增MAGE-3基因片段.连接入原核表达载体pGEX-4T-1,构建MAGE-3的原核表达质粒pGEX- MAGE-3并测序。将该质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,并通过谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统进行分离纯化。用纯化的融合蛋白GST-MAGE-3免疫新西兰大白兔,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western-blot检测抗体活性。【结果】构建了pGEX-MAGE-3原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后表达-相对分子质量约为72×103的蛋白,经GST融合蛋白纯化系统纯化,得到了MAGE-3的重组蛋白GST-MAGE-3。制备了兔抗GST-MAGE-3抗体。Western blot证实该抗体可与GST-MAGE-3蛋白特异性结合。【结论】获得了肿瘤抗原MAGE-3的纯化重组蛋白及其特异的多克隆抗体,为进一步研究MAGE-3抗原在肿瘤免疫治疗中的作用提供了一件检测工具。

MAGE-3抗原肽致敏DC疫苗抗膀胱癌细胞的体外实验

目的探讨黑色素瘤MAGE-3抗原肽致敏的树突状细胞(DC)疫苗体外抗膀胱癌细胞增殖作用及其分子机制。方法采用Ficoll法从HLA-A2型外周血中分离单核细胞,细胞因子GM-CSF和白细胞介素4(IL-4)诱导扩增DC细胞后经MAGE-3抗原肽致敏,致敏DC细胞和同型T淋巴细胞共培养法诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。MTT法检测抗原肽致敏DC对T淋巴细胞增殖的影响,CTL对靶细胞BIU-87的杀伤作用。采用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡和凋亡相关蛋白变化。结果MAGE-3抗原肽致敏的DC对T淋巴细胞增殖率具有明显提高作用,高于无关抗原致敏DC及未致敏DC。经MAGE-3九肽冲击的DC可有效诱导对MAGE-3阳性细胞BIU-87杀伤的CTL活性,而无关抗原肽及未经抗原肽致敏的DC则不具备其杀伤能力。结论MAGE-3九肽致敏DC能显著促进T淋巴细胞增殖并诱导有效杀伤靶细胞的CTL作用。

肿瘤抗原MAGE-3HLA-A2限制性CTL表位的预测

目的预测肿瘤抗原 MAGE- 3的 HL A- A2限制性 CTL 表位。方法以肿瘤特异性抗原 MAGE- 3为研究目标 ,采用基序方案和二级锚点相结合的 CTL 表位预测方法。结果预测出了 MAGE- 3的 6个 HL A- A2限制性 CTL 表位。结论所预测出的 6个 HL A- A2限制性 CTL 表位经后续实验筛选、鉴定后 ,可用于基于 MAGE-

小鼠I-A^kII类分子限制性MAGE-3T表位筛选

为了筛选小鼠MAGE-3抗原来源的MHCII类分子限制性多肽表位。用计算机模拟设计,从MAGE-3中选取得分最高的5个候选表位。根据诱导T淋巴细胞增殖能力、对肿瘤细胞的特异性识别及释放细胞因子能力评价多肽的免疫原性及免疫反应性。结果DC负载MAGE-322-36能够强效诱导T淋巴细胞增殖,DC负载MAGE-322-36诱导的T细胞以MHCII类分子限制性方式、特异性识别表达MAGE-3抗原的肿瘤细胞。DC负载MAGE-322-36诱导的T细胞群主要为CD4+Th1细胞,同时天然免疫系统中的NK、NKT、γ/δT细胞也得到活化。从小鼠MAGE-3抗原中筛选出MHCII类分子限制性多肽表位MAGE-322-36。

肿瘤抗原MAGE-3CTL预测表位的计算机分子模拟研究

目的 从理论上分析预测表位与HLA A2分子的结合情况及其为HLA A2限制性CTL表位的可能性。方法 应用计算机分子模拟的方法 ,建立MAGE 3 4个CTL预测表位的HLA A2结合三维结构和各多肽与HLA A2分子所形成复合物的三维结构。结果 4个预测表位的三维结构完全符合HLA A2限制性CTL表位的结构要求 ,且都能与HLA A2分子结合。结论 4个CTL预测表位为HLA

MAGE-1 MAGE-3及AFP基因在肝癌组织中的表达

目的:探讨MAGE-1、MAGE-3和AFP mRNA在肝癌组织中的表达及用于检测微小转移的可能性。方法:应用聚合酶链反应(PCR)检测86例原发性肝癌患者肝癌组织中MAGE-1、MAGE-3和AFP mRNA的表达。结果:86例原发性肝癌患者肝癌组织中MAGE-1、MAGE-3和AFP mRNA的阳性率分别为34.9%(30/86)、60.5%(52/86)和69.8%(60/86);所有患者肝癌组织至少表达其中一种mRNA。结论:MAGE-1、MAGE-3结合AFP mRNA在肝癌组织中表达率较高,有可能用于联合检测肝癌血行微小转移。

MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的 扩增人黑色素瘤抗原 3(Melanomaantigen 3,MAGE 3)基因 ,构建真核表达载体 ,并在小鼠黑色素细胞瘤B16中进行表达。方法 采用PCR扩增MAGE 3基因 ,连接到真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,构建真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G4 18筛选阳性克隆 ,荧光显微镜和RT PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白 (Enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的表达和MAGE 3mRNA的表达。结果 从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 95 0bp的片段 ,成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆 ,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光 ,RT PCR检测到MAGE 3mRNA的表达。结论 成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,获得了稳定表达该载体的小鼠黑色素瘤B16细胞系 ,为研究MAGE 3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。

MAGE-3原核表达载体的构建和表达

通过RT PCR扩增 95 7bp的MAGE 3全长编码序列 ,将该片段克隆至pGEX 4T 2原核表达载体 ,转化大肠杆菌BL 2 1,经IPTG诱导表达 ,并经 12 %SDS PAGE凝胶电泳 ,考马斯亮蓝染色及Westernblot鉴定 ,证明了目的基因的有效表达 ,目的蛋白高达细菌总蛋白的 32 %。表达产物经GlutathioneSepharose 4B纯化后 ,每 10 0mL菌液最终可获得 3mg的目的蛋白 ,蛋白纯度在 90 %以上。纯化的GST MAGE 3蛋白在体外冲击树突状细胞 。

小鼠MHCⅠ类分子限制性MAGE-3多肽表位筛选

目的筛选小鼠MAGE-3抗原来源的MHCⅠ类分子限制性多肽表位。方法用计算机模拟设计,从MAGE-3中选取得分最高的5个侯选表位。根据诱导T淋巴细胞增殖能力、对肿瘤细胞的特异性杀伤活性及释放细胞因子含量,评价多肽的免疫原性及免疫反应性。结果树突状细胞(DC)负载MAGE-341~49能够强效诱导T淋巴细胞增殖,DC负载MAGE-341~49诱导的T细胞以MHCⅠ类分子限制性方式,特异性识别表达MAGE-3抗原的肿瘤细胞。DC负载MAGE-341~49诱导的T细胞群主要为CD8+T细胞,同时天然免疫系统中的NKT、γ/δT也得到活化。结论从小鼠MAGE-3抗原中筛选出CD8+T细胞识别的、MHCⅠ类分子限制性多肽表位MAGE-341~49。

肺癌病人胸腔积液中MAGE-3基因表达的临床初步研究

目的探讨肺癌病人胸腔积液中MAGE-3基因的表达情况,为胸腔积液良恶性的鉴别提供新的诊断线索,进一步为恶性胸腔积液的基因治疗和肿瘤免疫治疗提供研究基础。方法选取20例肺癌合并胸腔积液病人为研究对象,无菌条件下抽取胸水20ml,立即离心取沉淀物,用TRIZOL裂解液抽提RNA,通过RT-PCR方法检测MAGE-3基因的表达情况,以结核性胸水和心衰病人胸水为对照,β-actin为内参照,同步检测基因的表达情况。结果20例肺癌合并胸腔积液病人胸水中检测到MAGE-3基因表达的有14例,阳性率70%,结核性胸水和心衰病人胸水中未检测到MAGE-3基因的表达。结论肺癌病人胸水中MAGE-3基因表达阳性率高,可作为进一步鉴别胸水良恶性的检测指标,为恶性胸腔积液、肿瘤的基因和免疫治疗的研究提供新的线索。

MAGE-3目的基因原核表达载体的构建和表达

目的构建原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌(E.coli)BL21中的表达,为制备以黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)基因片段为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下基础。方法通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法制备MAGE-3目的基因,以pGEM-TEasy为克隆载体,pGEX-4T-1为原核表达载体,将MAGE-3目的基因克隆至pGEM-TEasy载体和亚克隆至pGEX-4T-1载体上。筛选、鉴定阳性克隆并将其转化E.coliBL21.经IPTG诱导,12%SDS-PAGE电泳分离和WesternBlot表达鉴定。结果正确构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3;在E.coliBL21中检测到含该重组表达质粒的转化菌表达出分子量35kD的融合蛋白;基因测序结果表明,阳性克隆中的MAGE-3目的基因序列与GenBank公布的已知序列完全一致。结论成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3目的基因为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础;为后续实验提供了依据。

HLA-A＊0201／Kb及MAGE-3基因共转染B16细胞的制备及其在MAGE-3肿瘤疫苗评价中的作用

目的:为了用HLA-A2·1转基因鼠制备荷瘤模型以评价肿瘤疫苗的免疫效果,制备共表达HLA-A*0201/Kb嵌合基因和MAGE-3的B16黑色素瘤细胞。方法:采用基因共转染的方法,将HLA-A*0201/Kb和MAGE-3转染到B16黑色素瘤细胞(B16-HLA-MAGE-3),利用RT-PCR、流式细胞术(FCM)和Westernblot检测了HLA-A*0201/Kb和MAGE-3在B16黑色素瘤中的表达;通过测定CTL活性和体内抑瘤实验证实肿瘤抗原MAGE-3可以在B16-HLA-MAGE-3中得到有效加工处理和提呈。结果:RT-PCR、FCM和Westernblot检测到HLA-A*0201/Kb和MAGE-3在B16-HLA-MAGE-3黑色素瘤中的表达;LDH的方法观察到MAGE-3疫苗免疫小鼠脾细胞对B16-HLA-MAGE-3细胞的特异性CTL反应,抑瘤实验也证实,B16-HLA-MAGE-3细胞在免疫小鼠体内生长明显受到抑制。结论:MAGE-3基因在B16-HLA-MAGE-3黑色素瘤细胞中得到表达,并被有效的加工处理、提呈给特异性CD8+T细胞;B16-HLA-MAGE-3细胞可以用来制备荷瘤模型,且该方法适合利用转基因小鼠用于人表位疫苗的体内评价。

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达

目的 克隆肿瘤抗原MAGE 3基因 3’端 6 5 7bp片段 ,对其编码的蛋白羧基端 97～ 314aa进行原核表达。方法 从含人MAGE 3基因全长cDNA的pUC19 MAGE 3质粒中经聚合酶链式反应 (PCR)扩增 3’端 6 5 7bp片段 ,并克隆入pGEX 4T 1载体 ,构建重组原核表达质粒pGEX MAGE 3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达。结果 从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 6 6 0bp的条带 ,测序结果表明与GenBank公布的MAGE 3序列一致 ,成功地构建了pGEX MAGE 3原核表达质粒 ,含有该质粒的大肠杆菌DH5α经异丙基 β D 半乳糖苷 (Isopropyl beta D thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后表达Mr 为5 4 0 0 0的谷胱甘肽巯基转移酶 (GlutathioneS transferse,GST)融合蛋白。表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 2 8%。结论 成功地构建了pGEX MAGE 3原核表达质粒 ,获得了MAGE 3蛋白羧基端 97～ 314aa融合蛋白 ,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。